法夫酵母產(chǎn)新科斯糖的發(fā)酵條件

寧亞維, 張靜娟, 蘇丁, 楊哪, 徐學明

(1.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫 214122;2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

法夫酵母產(chǎn)新科斯糖的發(fā)酵條件

寧亞維1,2, 張靜娟2, 蘇丁2, 楊哪2, 徐學明1,2

(1.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫 214122;2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

通過單因素實驗及正交試驗對法夫酵母搖床發(fā)酵產(chǎn)新科斯糖的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,得出該菌株產(chǎn)新科斯糖的最佳發(fā)酵條件為:蔗糖110 g/L,玉米漿粉8 g/L,種齡48 h,接種體積分數(shù)10%,發(fā)酵周期24 h,初始p H 6.5,搖床轉(zhuǎn)速220 r/min,發(fā)酵溫度18℃。經(jīng)優(yōu)化后新科斯糖產(chǎn)量最高可達73.2 g/L,蔗糖利用率為66.5%,比優(yōu)化前發(fā)酵效率提高了87.1%。

法夫酵母;新科斯糖;蔗糖;搖瓶發(fā)酵

蔗果低聚糖(Fructooligosaccharides,FOS),又稱寡果糖或低聚果糖,廣泛存在于天然水果和蔬菜中,不僅口感良好,而且具有優(yōu)良的生理功能。它能促進腸道雙歧桿菌增殖,調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,改善和調(diào)節(jié)腸道功能,防治便秘和腹瀉;另外,具有低能量或無能量、預防齲齒、降低血清膽固醇、降低血脂和血壓等功效[1]。由此,FOS是一種國際上公認的功能性養(yǎng)生食品和新型糖源,在食品、飼料、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)應用廣泛[2]。目前工業(yè)上主要利用黑曲霉Aspergillus niger[3],青霉Penicillium citrinum[4],運動單胞菌Zymomonas mobilis[5],乳桿菌L actobacillus reutri[6]等來生產(chǎn)低聚果糖。由于大多數(shù)酵母所產(chǎn)的果糖苷酶具有很強的水解能力,最終又將合成的低聚果糖水解,導致低聚果糖產(chǎn)量甚少[7],因此目前對于酵母產(chǎn)低聚果糖的研究較少。

新科斯糖(neokestose)是一種蔗果三糖族低聚糖,由果糖基C-2與蔗糖分子中的葡萄糖基C-6位相連所得。它可由法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)發(fā)酵來生產(chǎn)。目前國內(nèi)外對法夫酵母的研究主要集中于蝦青素的發(fā)酵生產(chǎn)上,如高產(chǎn)蝦青素菌株選育[8]、發(fā)酵工藝研究[9]、色素提取[10]、色素穩(wěn)定性[11]及蝦青素的功能特性[12]等,且已能實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。而以法夫酵母為出發(fā)菌株,蔗糖為碳源進行發(fā)酵產(chǎn)新科斯糖的研究則鮮為報道,Kilian等人[13]發(fā)現(xiàn)法夫酵母在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長時能積累新科斯糖,國內(nèi)江南大學利用法夫酵母生產(chǎn)新科斯糖的方法已獲國家發(fā)明專利授權[14],蘇丁[15]對法夫酵母所產(chǎn)新科斯糖的結(jié)構進行了鑒定。作者主要就法夫酵母產(chǎn)新科斯糖的發(fā)酵條件進行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株:法夫酵母269,作者所在實驗室選育[8]。

培養(yǎng)基(g/L):種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基見文獻[14]。

主要試劑:新科斯糖標準品為作者所在實驗室制備[15],蔗糖等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 從斜面上挑一環(huán)菌,接入裝有25 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,22℃、220 r/min培養(yǎng)48 h作為種子液。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵 將種子培養(yǎng)液以體積分數(shù)5%接入發(fā)酵培養(yǎng)基,搖床轉(zhuǎn)速220 r/min,22℃發(fā)酵32 h。

1.2.3 分析方法

1)新科斯糖的測定:HPLC為島津LC-20A。色譜柱為Waters Sugarpak1,6.5 mmid×300 mm;流動相為超純水;流速為0.5 mL/min;檢測器為示差折光檢測器;進樣體積為10μL。

2)生物量的測定:干重法測定[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 蔗糖質(zhì)量濃度對發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的影響

碳源是構成菌體和合成新科斯糖的底物來源。通常作為碳源的物質(zhì),主要是各種糖類,淀粉等。根據(jù)文獻[17]報道,碳源除了蔗糖外,葡萄糖、果糖、淀粉等均對果糖基轉(zhuǎn)移酶活性不利。蔗糖既是酶作用的底物又是一種誘導物,故選擇蔗糖作為發(fā)酵產(chǎn)糖的惟一碳源。

以5.22 g/L酵母膏為氮源,蔗糖質(zhì)量濃度設置為70、90、110、130、150 g/L 5個水平進行比較,在22℃、220 r/min發(fā)酵32 h,結(jié)果見圖1。

圖1 蔗糖質(zhì)量濃度對法夫酵母產(chǎn)糖的影響Fig.1 Effect of sucrose concentration on the neokestose production byXanthophyllomyces dendrorhous

由圖1可以看出,隨著蔗糖質(zhì)量濃度增加,新科斯糖質(zhì)量濃度呈一定的上升趨勢,但糖利用率隨糖質(zhì)量濃度的增加而降低。綜合考慮所得新科斯糖產(chǎn)量和蔗糖轉(zhuǎn)化率,選取蔗糖質(zhì)量濃度為110 g/L進行搖瓶發(fā)酵。

2.1.2 氮源對發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的影響 以110 g/L蔗糖為碳源,分別用等摩爾量的不同氮源取代酵母膏,在22℃、220 r/min下發(fā)酵32 h,結(jié)果見圖2。

由圖2可知,當利用玉米漿粉作為發(fā)酵氮源時,菌體生長較好且新科斯糖產(chǎn)量最高,這與徐學明[16]等的研究結(jié)果相一致。玉米漿粉(或玉米漿)能顯著促進法夫酵母生長。玉米漿粉除含有豐富的可溶蛋白質(zhì)、生長素等為菌體生長繁殖提供營養(yǎng)外,還可能含有果糖苷酶合成的前體物質(zhì)。同時若采用玉米漿粉做氮源不僅有利于產(chǎn)物合成,而且還可在一定程度上降低發(fā)酵成本。因此作者選取玉米漿粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。

圖2 氮源對法夫酵母產(chǎn)糖的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources on the neokestose production byXanthophyllomyces dendrorhous

2.1.3 玉米漿粉質(zhì)量濃度對發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的影響 蔗糖110 g/L,配制玉米漿粉濃度分別為2、4、6、8、10 g/L的培養(yǎng)基,在22℃、220 r/min下發(fā)酵32 h后測定新科斯糖產(chǎn)量和生物量,結(jié)果見圖3。

圖3 玉米漿粉質(zhì)量濃度對法夫酵母產(chǎn)糖的影響Fig.3 Effect of corn syrup powder concentration on the neokestoseproductionbyXanthophyllomyces dendrorhous

圖3表明,適當提高玉米漿粉質(zhì)量濃度可提高新科斯糖產(chǎn)量,但玉米漿粉質(zhì)量濃度大于8 g/L時,由于氮源過多導致菌體生長過旺,使底物蔗糖過早耗盡,從而使得新科斯糖的合成受到抑制。

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 接種體積分數(shù)對法夫酵母產(chǎn)新科斯糖的影響 分別以體積分數(shù)2%、4%、6%、8%、10%、12%的接種量在25 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種子液,32 h后測定其新科斯糖產(chǎn)量及生物量,結(jié)果見圖4。

圖4 接種體積分數(shù)對法夫酵母產(chǎn)糖的影響Fig.4 Effect of inoculum concentration on the neokestose production byXanthophyllomyces dendrorhous

由圖4可知,接種體積分數(shù)為10%時,新科斯糖產(chǎn)量最高。隨著接種體積分數(shù)的增加,新科斯糖產(chǎn)量也隨之增大,但當接種體積分數(shù)大于10%時,新科斯糖產(chǎn)量開始降低。這表明較大的接種體積分數(shù)可以縮短發(fā)酵周期,減少雜菌的生長機會;但接種體積分數(shù)過高則引起溶氧不足,最終導致新科斯糖產(chǎn)量降低。Chien[18]等在用固定化Aspergillus japonicus生產(chǎn)低聚果糖時也有類似的發(fā)現(xiàn)。

2.2.2 初始p H值對法夫酵母產(chǎn)新科斯糖的影響

蔗糖110 g/L,玉米漿粉為8 g/L,配制p H分別為3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的培養(yǎng)基,22℃、220 r/min下發(fā)酵32 h后測定其新科斯糖產(chǎn)量及生物量,結(jié)果見圖5。

初始p H值對法夫酵母產(chǎn)糖影響較大。p H值在5～8范圍內(nèi)時新科斯糖產(chǎn)量均較高。這一結(jié)果表明,法夫酵母所產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適p H值接近中性,與kilian[19]的研究一致。

圖5 初始pH值對法夫酵母產(chǎn)糖的影響Fig.5 Effect of initial pH on the neokestose production byXanthophyllomyces dendrorhous

2.2.3 發(fā)酵溫度對法夫酵母產(chǎn)新科斯糖的影響蔗糖110 g/L,玉米漿粉8 g/L,p H 6.0,溫度分別設置為18、20、22、24、28、32℃,在220 r/min的轉(zhuǎn)速下發(fā)酵32 h后測定新科斯糖產(chǎn)量及生物量。

圖6 發(fā)酵溫度對法夫酵母產(chǎn)糖的影響Fig.6 Effect of temperature on the neokestose production byXanthophyllomyces dendrorhous

由圖6可知,法夫酵母發(fā)酵產(chǎn)新科斯糖在培養(yǎng)溫度為20℃時效果最好,新科斯糖產(chǎn)量最高,這與徐學明等[16]的研究結(jié)果一致,法夫酵母的發(fā)酵溫度較低,在16～22℃范圍內(nèi)生長較好。

2.2.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的影響 以體積分數(shù)10%接種量將種子培養(yǎng)基接入上述已優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵4、8、12、16、24、36、48、72 h后分別測定新科斯糖產(chǎn)量及生物量,結(jié)果見圖7。

圖7 法夫酵母發(fā)酵進程曲線Fig.7 The time-course of the neokestose production byXanthophyllomyces dendrorhous

圖7進程曲線表明,前12 h時酵母迅速利用蔗糖,新科斯糖迅速積累,到24 h時,新科斯糖產(chǎn)量達到最高,以后各糖質(zhì)量濃度基本保持不變,因此確定發(fā)酵時間為24 h。

2.2.5 種齡對法夫酵母產(chǎn)新科斯糖的影響 適宜種齡菌體接種可以縮短發(fā)酵周期,同時種齡也是決定產(chǎn)酶的重要因素,因此利用最佳種子進行發(fā)酵可獲取較高新科斯糖產(chǎn)量。

作者分別選取培養(yǎng)16、24、32、40、48、60、72、84 h后的種子培養(yǎng)基,均以體積分數(shù)10%接種量接入裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,初始p H為6.0,培養(yǎng)24 h后分別測定新科斯糖產(chǎn)量和生物量。由圖8可知,新科斯糖產(chǎn)量以48 h的種齡為最佳。種齡小于48 h時,由于質(zhì)量細胞處于幼嫩的指數(shù)期,接入發(fā)酵培養(yǎng)基時受高質(zhì)量濃度蔗糖抑制作用較明顯,生物量小,果糖苷酶較少,因此新科斯糖產(chǎn)量較低。

圖8 種齡對法夫酵母產(chǎn)新科斯糖的影響Fig.8 Effect of inoculum age on the neokestose production byXanthophyllomyces dendrorhous

2.3 正交試驗

通過反復試驗得知,蔗糖質(zhì)量濃度、初始p H值、發(fā)酵溫度是影響新科斯糖產(chǎn)量的重要因素。實驗以新科斯糖產(chǎn)量和蔗糖轉(zhuǎn)化率為指標,采用正交試驗優(yōu)化法夫酵母產(chǎn)新科斯糖的發(fā)酵條件,結(jié)果見表1～3。

表1 正交試驗因素及水平Tab.1 The factors and levels of experiment

表2 L9(34)正交試驗方案及結(jié)果Tab.2 The design and results

表3 新科斯糖產(chǎn)量、蔗糖轉(zhuǎn)化率極差分析結(jié)果Tab.3 The range analytic results of neokestose and sucrose yield

由圖9正交試驗結(jié)果效應曲線圖可以看出:在對新科斯糖產(chǎn)量的影響中,影響因素為A>B>C;表4方差分析表明,蔗糖質(zhì)量濃度對新科斯糖產(chǎn)量影響極顯著,是主要影響因素。這是由于在產(chǎn)糖過程中,蔗糖作為果糖苷酶的誘導物以及新科斯糖合成的底物而發(fā)揮了主要作用。在對蔗糖利用率的影響中,影響因素為A>B>C,其中蔗糖質(zhì)量濃度和p H值影響顯著。這一方面證實了蔗糖的誘導作用,另一方面說明p H值直接影響果糖苷酶的活力,即p H值過高或過低都會使其水解能力下降。綜合兩個指標及極差分析,確定最佳發(fā)酵條件為:蔗糖110 g/L,玉米漿粉8 g/L,p H 6.5,接種體積分數(shù)10%,18℃,24 h。以此條件發(fā)酵培養(yǎng),結(jié)果所得新科斯糖產(chǎn)量為73.2 g/L,蔗糖利用率為66.5%,比優(yōu)化前發(fā)酵效率提高了87.1%。

表4 正交試驗方差分析表Tab.4 The variance analysis of orthogonal results

圖9 正交試驗效應曲線圖Fig.9 The effect curve of orthogonal experiment

3 結(jié) 語

法夫酵母269能有效地將蔗糖轉(zhuǎn)化為功能性低聚果糖——新科斯糖。該菌株產(chǎn)新科斯糖的能力受蔗糖質(zhì)量濃度、氮源種類與質(zhì)量濃度、培養(yǎng)基初始p H值、種齡、接種體積分數(shù)、發(fā)酵溫度和時間等因素影響,其中尤其以蔗糖質(zhì)量濃度與初始p H值影響最大。優(yōu)化條件下發(fā)酵可使新科斯糖產(chǎn)量達到73.2 g/L發(fā)酵液,比優(yōu)化前發(fā)酵效率提高87.1%。

[1]鄭建仙.功能性低聚糖[M].北京:化學工業(yè)出版社,2004:1-6.

[2]尤新.功能性低聚糖發(fā)展動向及前景[J].中國食品添加劑,2008,3:45-49.

YOU Xin.Function and prospect on oligosaccharide[J].China Food Additives,2008,3:45-49.(in Chinese)

[3]Nizhizawa K,Nakajima M,Nabetani H.Kinetic study on transfructosylation by(-fructofuranosidase fromAspergillus nigerATCC 20611 and availability of a membrane reactor for Fructooligosaccharide production[J].Food Science and Technology Research,2001,7:39-44.

[4]Hayashi S,Yoshiyama T,Fuji N,et al.Production of a novel syrup containing neofructooligosaccharides by the cells ofPenicillium citrinum[J].Biotechnology Letters,2000,22:1465-1469.

[5]Blecker C,Fouguies C,Van Herck J C,et al.Kinetic study of the acid hydrolysis of various oligofructose samples[J]. Journal of Agricultural Chemistry,2002,50:1602-1607.

[6]Van Hijum S,Van Geel-Schutten G H,Rahouri H,et al.Characterization of a novel fructosyl transferase fromL actobacillus reutrithat synthesizes high molecular weight inulin and inulin oligosaccharides[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68:4390-4398.

[7]鄭建仙.功能性食品生物技術[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2004.

[8]徐學明,金征宇,呂玉華.蝦青素高產(chǎn)突變株的選育[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2000,26(5):22-27.

XU Xue-ming,J IN Zheng-yu,LU Yu-hua.Studies on astaxanthin overproducing mutants ofPhaf f ia rhodozyma[J].Food and Fermentation Industries,2000,26(5):22-27.(in Chinese)

[9]徐學明,金征宇,劉當慧.法夫酵母產(chǎn)蝦青素的補料發(fā)酵[J].食品與生物技術學報,2002,21(1):5-9.

XU Xue-ming,J IN Zheng-yu,LIU Dang-hui.Fed-batch culture of astaxanthin producing strainPhaf f ia rhodozyma[J]. Journal of Food Science and Biotechnology,2002,21(1):5-9(in Chinese)

[10]Johnson E A.Phaf f ia rhodozyma:colorful odyssey[J].Int Microbiol,2003,6:169-174.

[11]徐學明,陳曉明,金征宇.法夫酵母中蝦青素的穩(wěn)定性研究[J].食品與生物技術學報,2006,25(4):29-36.

XU Xue-ming,CHEN Xiao-ming,J IN Zheng-yu.Stability of astaxanthin fromXanthophyllomyces dendrorhousdurning storage[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2006,25(4):29-36.

[12]An G H,Choi E S.Preparation of the red yeast,Xanthophyllomyces dendrorhous,as feed additive with increased availability of astaxanthin[J].Biotechnol Lett,2003,25:767-771.

[13]Kilian S G,Sutherland F C W.Transport-limited sucrose utilization and neokestose production byPhaf f ia rhodozyma[J].Biotechnol Lett,1996,18:975-980.

[14]徐學明,張靜娟,金征宇.一種低聚糖-新科斯糖的發(fā)酵法生產(chǎn)方法[P].中國專利:CN100392091C,2008-06-04.

[15]蘇丁,陳曉明,徐學明.法夫酵母低聚糖結(jié)構分析的研究[J].食品與生物技術學報,2009,28(2):197-200.

SU Ding,CHEN Xiao-ming,XU Xue-ming.Identification of the structure of oligosaccharide produced fromXanthophyllomyces dendrorhous[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2009,28(2):197-200.

[16]徐學明,金征宇,劉當慧.法夫酵母產(chǎn)蝦青素的搖瓶工藝[J].無錫輕工大學學報,2000,19(3):230-235.

XU Xue-ming,J IN Zheng-yu,LIU Dang-hui.Astaxanthin production byPhaff a rhodozyma[J].Journal of Wuxi University of Light Industry,2000,19(3):230-235.

[17]Bonnin E,Thibault J F.Galactooligosaccharide production by transfer reaction of an exogalactanase[J].Enzyme Microb Technol,1996,19:99-106.

[18]Chien C S,Lee W C,Lin T J.Immobilization ofAspergillus japonicusby entrapping cells in gluten for production of fructooligosaccharides[J].Enzyme Microb Technol,2001,29:257-525.

[19]Kritzinger,Kilian.The effect of production parameters on the synthesis of the prebiotic trisaccharide,neokestose,byXanthophyllomyces dendrorhous(Phaff ia rhodozyma)[J].Enzyme Microb Technol,2003,32:728-737.

(責任編輯:李春麗)

Studies on Fermentation Conditions for Production of Neokestose byXanthophyllomyces dendrorhous

NING Ya-wei1,2, ZHAN GJing-juan2, SU Ding2, YANG Na2, XU Xue-ming1,2
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Wuxi 214122,China;2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

In ordertofurtherimprovethetiterandyield ofneokestoseproductionby Xanthophyllomyces dendrorhous,the medium compositions and environmental conditions for neokestose production were optimum by the single factor experiment and the orthogonal experiments,and listed as follows:sucrose 110 g/L,dried corn steep liquor powder 9 g/L,p H 6.5,rotation speed of shaker 220 r/min and inoculation size10%in 25 mL of culture medium in the 250 mL flasks at 18℃for 24 h.The concentration of neokestose by Xanthophyllomyces dendrorhous 269 was achieved at 73.2 g/L,the yield of neokestose on sucrose reached at 66.5%, which was 1.87 times than that of the control.

Xanthophyllomyces dendrorhous,neokestose,fructo-oligosaccharides,submerged fermentation

TQ 920.1

:A

1673-1689(2010)03-0458-06

2009-07-08

教育部優(yōu)秀人才計劃項目(NCET-07-0379)。

＊通信作者:徐學明(1968-),男,江蘇蘇州人,教授,工學博士,博士生導師,主要從事糧食油脂及植物蛋白工程方面的研究。Email:xmbest@126.com