難治性顳葉癲癇患者顳葉皮層 GRP78、caspase4的表達

劉功祿, 趙永波, 趙圣杰, 肖 倩, 沈 原

動物模型及臨床病理標本研究均表明,癲癇反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡[1,2]。死亡受體活化(外源性途徑)和線粒體損傷途徑(內(nèi)源性途徑)是細胞內(nèi)兩條經(jīng)典的凋亡途徑,大多數(shù)對癲癇后引起的神經(jīng)元凋亡的研究集中于這兩條途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)啟動的凋亡途徑是近年才發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑。但 ERS在癲癇后腦損傷中的作用機制還遠未闡明。葡糖糖調(diào)節(jié)激酶(glucose regulated protein,GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)典的標志分子,而 caspase4在人類 ERS反應(yīng)性細胞凋亡途徑中具有關(guān)鍵性作用。為探討 ERS在癲癇腦損傷中的作用,我們采用免疫組化及 Western blot法分別檢測了難治性顳葉癲癇手術(shù)切除的顳葉皮層腦組織 GRP78、caspase4的表達。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 32例難治性顳葉癲癇患者均來自 2008.1～2009.1上海交通大學(xué)附屬仁濟醫(yī)院和上海曲陽醫(yī)院神經(jīng)外科住院手術(shù)患者,其中男 19例,女 13例;年齡 6～41歲,平均 27.9±7.8歲;病程 4～32年,平均 13.5±7.5年;發(fā)作頻率 3～55次/m,平均 12.4±13.5次/m?；颊叨加邪d癇的典型表現(xiàn),發(fā)作類型符合國際抗癲癇聯(lián)盟 1981年有關(guān)癲癇發(fā)作分類的規(guī)定,并符合以下條件:(1)用 2種以上抗癲癇藥,正規(guī)治療 2年以上,與發(fā)作基線相比,發(fā)作無明顯減少;(2)頭部 CT或 MRI掃描除海馬硬化外無顱內(nèi)占位性病變或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病;(3)術(shù)前 24h頭皮腦電圖及術(shù)前 1w放置硬膜下電極皮層腦電圖監(jiān)測,癲癇灶定位于一側(cè)的顳葉皮層和(或)海馬;(4)手術(shù)中沒有發(fā)現(xiàn)除癲癇外其他神經(jīng)系統(tǒng)病變和可能引起癲癇發(fā)作的病因;(5)術(shù)后組織病理證實為神經(jīng)元變性、膠質(zhì)增生等非特異性改變;(6)患者及家屬術(shù)前簽署知情同意書。其中復(fù)雜部分性發(fā)作 22例,全身強直-陣攣發(fā)作 5例,復(fù)雜部分性發(fā)作繼發(fā)全身強直-陣攣發(fā)作發(fā)作 5例。對照組 15例,男 9例,女 8例,年齡構(gòu)成與病例組接近,均無癲癇發(fā)作史及家族史。其中 5例為顳葉前中部腦血管畸形手術(shù)切除獲得的顳葉腦組織,15例為腦外傷顱內(nèi)高壓減壓術(shù)術(shù)中采集顳葉腦組織,病理切片檢查未見組織異常,所有患者均簽署知情同意并且標本獲取得到醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 標本收集和保存 癲癇組和對照組患者顳葉皮層腦組織在術(shù)中采集,標本取出后部分立即放入液氮中,后放置在 -80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?部分置于 4%多聚甲醛中固定 48h,隨后常規(guī)石蠟包埋切片,常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫組化檢測 癲癇組和對照組腦組織常規(guī)石蠟包埋后(癲癇組,n=14;對照組,n=6),石蠟切片機行連續(xù)冠狀切片,片厚 5μm。每個標本隨機切 10片,然后每份隨機抽取 2片組成新待測樣本。采用 SP免疫組化法進行檢測(UltraSensitiveTM S-P免疫組化試劑盒,福州邁新生物技術(shù)有限公司),切片經(jīng)脫蠟抗原熱修復(fù),血清封閉液封閉后,滴加一抗 GRP78(兔單克隆抗體,1∶50,Cell Sigaling Technology公司)、Caspase4(兔多克隆抗體,1∶50,Abcam公司),4℃孵育過夜,然后滴加生物素標記的羊抗兔二抗室溫孵育 30min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片。用 PBS代替一抗作陰性對照。以胞質(zhì)染成棕黃色為陽性。每張切片采用 AxioVision 3.1光學(xué)顯微鏡聯(lián)合 Axioplan 2顯微成像系統(tǒng)進行攝片(Carl Zeiss公司),應(yīng)用 Imagepro-Plus圖像分析系統(tǒng)測定光密度(optical density,OD)值。

1.4 Western blot檢測 腦組織樣本(癲癇組,n=18,對照組,n=9)采用核-胞漿蛋白裂解液裂解蛋白,Bradford法蛋白定量。每泳道上樣 50μg,8%SDS-PAGE凝膠電泳分離后濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜。封閉后加入一抗(GRP78,1∶1000;Caspase4,1∶500)及內(nèi)參照 GAPDH(鼠單克隆抗體,1∶2000),4℃孵育過夜后二抗室溫孵育 45min。ECL發(fā)光試劑反應(yīng) 1min,暗室內(nèi) x線片曝光,顯影,定影。獲得的條帶膠片用 Acer掃描儀掃描,應(yīng)用 Imagepro-Plus圖像分析系統(tǒng)測定 OD值,用同一標本內(nèi)參 GAPDH的光密度值進行校正,按公式 OD相對值 =目的條帶表達強度/GAPDH表達強度,計算出相對值進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化結(jié)果 在對照組正常顳葉腦組織中僅見少量 GRP78陽性神經(jīng)元,癲癇組 GRP78陽性神經(jīng)元明顯增多,主要在神經(jīng)元的胞漿內(nèi)表達,經(jīng)OD值比較,兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.464,P＜0.05)(見表1、圖1)。在對照組檢測到較弱 Caspase4表達,而癲癇組 caspase4免疫反應(yīng)明顯增強,陽性神經(jīng)元明顯增多,主要在神經(jīng)元的胞漿內(nèi)表達,經(jīng) OD值比較,兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.740,P＜0.05)(見表2、圖2)。

2.2 Western blot結(jié)果 對照組 GRP78、Caspase4蛋白條帶較弱,癲癇組 GRP78、Caspase4蛋白條帶較對照組明顯增強(見圖1、圖2),兩組兩種蛋白 OD相對值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(GRP78,t=12.913,P＜0.05;Caspase4,t=9.956,P＜0.05)(見表3、表4)。

表1 GRP78蛋白免疫組化染色結(jié)果±s)

表1 GRP78蛋白免疫組化染色結(jié)果±s)

與對照組比較t=15.464,*P＜0.05

癲癇組對照組1460.767±0.077*0.242±0.031

表2 Caspase4蛋白免疫組化染色結(jié)果±s)

表2 Caspase4蛋白免疫組化染色結(jié)果±s)

與對照組比較t=14.740,*P＜0.05

癲癇組對照組1460.712±0.073*0.225±0.035

表3 GRP78 Western印跡結(jié)果±s)

表3 GRP78 Western印跡結(jié)果±s)

與對照組比較 t=12.913,*P＜0.05

癲癇組對照組1890.713±0.017*0.498±0.037

表4 Caspase4 western印跡結(jié)果±s)

表4 Caspase4 western印跡結(jié)果±s)

與對照組比較,t=9.956,*P＜0.05

癲癇組對照組1890.519±0.025*0.315±0.043

圖1 GRP78在難治性顳葉癲癇患者顳葉腦組織中的表達

圖2 Caspase-4在難治性顳葉癲癇患者顳葉腦組織中的表達

3 討 論

顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy,TLE)是難治性癲癇中最常見的類型,約占難治性癲癇的 60%～70%。癲癇反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡和多種凋亡相關(guān)基因的表達[3]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是哺乳細胞中一種重要的亞細胞器,也是重要的鈣離子貯存庫。它是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成及合成后折疊、聚集的場所,是調(diào)節(jié)細胞的應(yīng)激反應(yīng)及細胞鈣水平的場所。在某些應(yīng)激情況下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微環(huán)境發(fā)生改變,蛋白質(zhì)的折疊受到影響,導(dǎo)致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi),由此引起一系列分子伴侶(如GRP78)和折疊酶表達上調(diào)為標志的應(yīng)答反應(yīng),稱為非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response,UPR),整個應(yīng)激及其激發(fā)的應(yīng)答過程稱為 ERS[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過激活 UPR以保護由 ERS所引起的細胞損傷,恢復(fù)細胞功能。然而 ERS持久或過度,就會誘導(dǎo)細胞損傷、凋亡[5]。癲癇發(fā)作導(dǎo)致機體氧耗增加、呼吸暫停和血管舒縮功能異常而繼發(fā)腦缺血、缺氧反應(yīng),誘導(dǎo)缺血缺氧性腦損傷。這種病理狀態(tài)下,GABA減少、神經(jīng)元突觸后抑制作用減弱,NMDA受體通道開放增加,引起神經(jīng)元興奮毒性損傷,而細胞膜去極化導(dǎo)致電壓依賴性 Ca2+通道開放,導(dǎo)致突觸前興奮性氨基酸釋放增加,其與突觸后相應(yīng)受體結(jié)合后又導(dǎo)致細胞外 Ca2+內(nèi)流,這一系列病理生理過程均可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。Henshall等[6]認為癲癇的病理生理過程可以激活觸發(fā) ERS,其誘導(dǎo)啟動的UPR保護性適應(yīng)和損傷機制均參與了驚厥誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷過程,具體機制尚不清楚。

GRP78是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上最多的應(yīng)激蛋白,又稱葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白,屬于熱休克蛋白家族。其主要功能是幫助新生多肽鏈的折疊、裝配和轉(zhuǎn)運,在缺血缺氧、鈣離子失衡、氧化應(yīng)激等各種應(yīng)激環(huán)境下,GRP78的表達量顯著增高,協(xié)助變性蛋白進行重新裝配和跨膜轉(zhuǎn)運,緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。因此,GRP78被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標志性分子[7]。本研究檢測了頑固性顳葉癲癇患者癲癇灶內(nèi) GRP78的表達。免疫組化和 Western印記結(jié)果顯示癲癇組GRP78較對照組表達明顯增加(見表1、表3、圖1),提示癲癇反復(fù)發(fā)作誘發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。GRP78通過促進蛋白質(zhì)的正確折疊提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)能力,在癲癇發(fā)作中起到保護神經(jīng)元、對抗凋亡的作用。當這些機制不足以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡時,細胞將啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡程序,清除不健康的細胞,所以 GRP78的表達反映了細胞的損傷情況和應(yīng)激能力,對決定細胞的結(jié)局如抵抗、適應(yīng)、損傷或凋亡等有重要作用。將來通過干預(yù) GRP78的表達水平,有望成為癲癇發(fā)作后腦損傷的新的腦保護藥物,甚至成為治療頑固性癲癇新的藥物靶點。

Caspase-12作為 ER膜上的促凋亡分子,是 ERS介導(dǎo)的細胞凋亡關(guān)鍵分子,其活化是凋亡的中心環(huán)節(jié),在死亡受體或線粒體凋亡途徑中不被活化。但caspase-12僅在某些嚙齒類哺乳動物中存在,在人類由于 caspase-12基因存在幾種突變子使其功能失活[8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),人類基因中的 caspase-4在人類ERS反應(yīng)性凋亡途徑中起到 “caspase-12”的作用[9]。為了研究 caspase4是否參與了癲癇腦損傷,我們應(yīng)用免疫組化和 Western印記技術(shù)檢測了頑固性顳葉癲癇患者癲癇灶腦組織 caspase-4的表達水平。結(jié)果顯示癲癇組 caspase-4表達水平明顯增加,Western印記還檢測到了 caspase-4的活化形式(cleaved)。因此,本研究提示 caspase-4可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑介導(dǎo)了癲癇后神經(jīng)元凋亡損傷,但其具體功能機制尚需進一步研究。caspase-4可能與caspase-12有類似的激活機制:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能通過需鈣蛋白酶對原 caspase-4裂解或通過 GRP78/caspase-7復(fù)合物介導(dǎo)的機制而使 caspase-12激活。另外,腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,TRAF2)能與caspase-4相互作用,切割 caspase-4使其活化?；罨?caspase-4進一步激活 caspase-9和 caspase-3,引起細胞凋亡。

本實驗結(jié)果提示難治性顳葉癲癇反復(fù)發(fā)作后誘發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,表現(xiàn)為 GRP78表達增加,同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性凋亡蛋白酶 caspase-4表達增加、活化,可能介導(dǎo)了癲癇后神經(jīng)元凋亡損傷。但關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在癲癇腦損傷中的作用機制研究還剛剛起步,還有許多問題亟待解決。隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在癲癇腦損傷及其發(fā)病機制中的深入研究,人們必將能找到有效的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞損傷,從而為癲癇的治療尋找新的途徑。

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