野生型p53誘導(dǎo)基因1研究進(jìn)展*

鄒瀛波綜述,郭 偉,蔣耀光審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所全軍胸外科中心,重慶 400042)

p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因。過去20多年來,人們對p53基因的認(rèn)識經(jīng)歷了癌蛋白抗原,癌基因到抑癌基因的3個認(rèn)識轉(zhuǎn)變,現(xiàn)已認(rèn)識到,引起腫瘤形成或細(xì)胞轉(zhuǎn)化的突變型p53蛋白是野生型p53基因突變的產(chǎn)物,是一種腫瘤促進(jìn)因子,它可以抑制正常p53蛋白的功能,而野生型p53基因是一種抑癌基因,它的失活對腫瘤形成起重要作用[1]。

目前研究已經(jīng)證實,p53可以誘導(dǎo)多種基因的表達(dá),然而到目前為止,研究者尚未發(fā)現(xiàn)僅影響p53依賴凋亡途徑的單一基因。在野生型p53誘導(dǎo)基因1(wild-type p53-induced gene 1,WIG-1)被發(fā)現(xiàn)之前,研究者猜測p53誘導(dǎo)的凋亡可能與一種還未被命名的p53相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān),同樣,p53在諸如分化和發(fā)育過程中的功能可能依賴于這一特殊基因的調(diào)節(jié)。之后的研究結(jié)果表明WIG-1有可能是影響p53依賴凋亡途徑的調(diào)節(jié)基因[2],因此,對于WIG-1基因的進(jìn)一步研究,將有可能為闡明p53誘導(dǎo)生理途徑的分子機制提供有益的思路和見解。

1 WIG-1的發(fā)現(xiàn)

1995年,Leone等[3]通過對J3D小鼠T淋巴瘤細(xì)胞周期和凋亡進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn),在溫度敏感的結(jié)構(gòu)中表達(dá)的野生型p53(溫度敏感p53基因)能夠誘導(dǎo)p53陰性的J3D小鼠T淋巴瘤細(xì)胞出現(xiàn)G1期停滯和細(xì)胞凋亡。p53通過一段特殊序列與DNA結(jié)合,并激活帶有特殊p53DNA基因的轉(zhuǎn)錄子,這種特殊的p53DNA和它們的啟動子結(jié)合在一起。p53的這種由特殊序列激活的功能對于p53介導(dǎo)的體外生長抑制作用是至關(guān)重要的[4]。這些發(fā)現(xiàn)表明,特殊的DNA結(jié)合序列及其活性對于p53的腫瘤抑制起到了決定性作用。對結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)了一個新的p53誘導(dǎo)的基因——WIG-1,其7.6 kb的和2.2 kb的轉(zhuǎn)錄子在溫度敏感的p53轉(zhuǎn)染的J3D細(xì)胞中的表達(dá)是上調(diào)的。細(xì)胞經(jīng)γ射線照射后過表達(dá)的NIH3T3和p21可以誘導(dǎo)WIG-1的轉(zhuǎn)錄。全身γ射線照射可以誘導(dǎo)鼠的腦、睪丸、腎、脾和肺組織 WIG-1表達(dá)水平上調(diào),而在未接受γ射線照射的腦、睪丸和腎組織中也可檢測到WIG-1的基礎(chǔ)表達(dá)[4]。進(jìn)一步的研究表明,WIG-1是一種由p53基因誘導(dǎo)表達(dá)的鋅指蛋白,在其分子中含有3個鋅指結(jié)構(gòu),WIG-1蛋白中的3個鋅指結(jié)構(gòu)能夠與特定蛋白、RNA及DNA結(jié)合,人類WIG-1與包括小干擾RNA和microRNA在內(nèi)的不同類型的雙鏈RNA結(jié)合后,能夠發(fā)揮抑制細(xì)胞生長的作用[5]。

另外,有研究者發(fā)現(xiàn),用阿霉素等抗腫瘤藥物處理攜帶野生型p53基因的B淋巴細(xì)胞,在p53過表達(dá)的同時可以檢測到WIG-1的表達(dá)水平上調(diào)[6]。結(jié)果進(jìn)一步表明WIG-1的表達(dá)可以由p53誘導(dǎo),因此,WIG-1是一個p53誘導(dǎo)基因。

目前已發(fā)現(xiàn)的WIG-1同源體有:嚙齒類動物細(xì)胞中的PAG608(p53-activated gene 608,p53激活基因608)和哺乳動物細(xì)胞中的ZMA T-3(zinc finger,matrin type 3,鋅指基質(zhì)蛋白3)。PAG608在嚙齒類動物所有組織中都可以檢測到其表達(dá),而在胰腺、腦和肺組織中的表達(dá)水平最高[7]。

2 WIG-1的結(jié)構(gòu)與定位

WIG-1定位于細(xì)胞核,編碼包含3個Cys2his2型鋅指的鋅指蛋白,WIG-1的鋅指是由56～75個氨基酸連接而成的,定位于人類3號染色體長臂的26.3區(qū)(3q26.3),見圖 1[8]。

圖1 WIG-1定位圖

WIG-1在轉(zhuǎn)錄水平的選擇性拼接可以產(chǎn)生兩種轉(zhuǎn)錄變異體(轉(zhuǎn)錄變異體1及轉(zhuǎn)錄變異體2),兩種變異體序列中僅僅有一個氨基酸不同。相對于轉(zhuǎn)錄變異體1,轉(zhuǎn)錄變異體2在5′端的非編碼區(qū)缺少一個片段,在編碼區(qū)存在一個替代剪接位點,其開放讀碼框沒有GCA密碼子,編碼序列含有288個氨基酸。WIG-1在生物進(jìn)化過程中高度保守,其鋅指蛋白氨基酸序列及結(jié)構(gòu)在人類與魚類中幾乎完全一致[9]。這些鋅指區(qū)域類似于早先發(fā)現(xiàn)的雙鏈RNA結(jié)合蛋白,dsRBP-ZFa和JAZ。小鼠WIG-1與JAZ和dsRBP-ZFa一樣是一個核蛋白,與其具有結(jié)構(gòu)相似性。這種Cys2his2型鋅指蛋白代表了一大類具有識別特殊DNA序列的蛋白,然而,這種蛋白也與單鏈RNA、DNARNA雜合體,dsDNA(雙鏈DNA)和其他蛋白相互作用。同JAZ一樣,WIG-1也定位于核內(nèi),這與小鼠WIG-1蛋白和已觀察到的人與大鼠WIG-1蛋白在核內(nèi)與核仁內(nèi)的定位是一致的。由于WIG-1與dsRNA(雙鏈RNA)而不是 ssRNA(單鏈RNA)相作用,所以WIG-1代表了一類與以往發(fā)現(xiàn)所不同的p53誘導(dǎo)基因[10]。

3 WIG-1的功能

3.1 與dsRNA的結(jié)合活性 目前研究己經(jīng)證實小鼠WIG-1通過其第1個鋅指區(qū)域與dsRNA相結(jié)合。異常表達(dá)FLAG標(biāo)記的鼠WIG-1蛋白定位于細(xì)胞核,在某些細(xì)胞中定位于核仁,而GFP標(biāo)記的鼠WIG-1則主要定位于核仁,WIG-1優(yōu)先與dsRNA結(jié)合,而不是ssRNA或者dsDNA,WIG-1的第1個鋅指區(qū)域?qū)τ赿sRNA結(jié)合功能至關(guān)重要,而鋅指2和3則不是必需的。在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的WIG-1蛋白顯示出與

dsRNA的高度親和性,而在所有p53誘導(dǎo)表達(dá)的基因中,類似WIG-1的dsRNA結(jié)合活性是首次發(fā)現(xiàn)。這表明 WIG-1與JAZ和dsRBP-ZFa等dsRNA結(jié)合蛋白具有結(jié)構(gòu)相似性,也進(jìn)一步提示dsRNA結(jié)合在p53依賴的生理反應(yīng)中可能具有重要作用[11]。

WIG-1由野生型p53誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),是p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化的一個直接靶點。已有研究證實其是一個由p53直接轉(zhuǎn)錄的基因,并且是一個善意的目的基因,WIG-1的3個鋅指區(qū)域包含在其第2、第4外顯子核苷酸序列中,其與p53結(jié)合的同一序列相關(guān)。其中的2個鋅指區(qū)域BM2和BM3,與重組p53共同形成DNA蛋白雜合體[12]。

WIG-1的第1個鋅指區(qū)域?qū)τ谠隗w外或活體細(xì)胞中結(jié)合dsRNA至關(guān)重要。野生型 WIG-1和ZF1、ZF2點突變型WIG-1都具有抑制細(xì)胞克隆形成能力的作用,證明這兩個ZF突變對WIG-1抑制細(xì)胞增殖功能未造成重要的影響,但進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)突變型WIG-1的復(fù)制效率要低于野生型WIG-1[11]。

有研究發(fā)現(xiàn),人類WIG-1也結(jié)合dsRNA,WIG-1與活細(xì)胞中內(nèi)生dsRNA的互相作用表明這種相互作用是與生理性相關(guān)的,但是它的確切機制和作用目前仍不清楚。WIG-1通過其N末端的鋅指區(qū)域與50～100 bp長的dsRNA結(jié)合,WIG-1結(jié)合的21 bp的dsRNA與siRNA具有結(jié)構(gòu)相似性。這些結(jié)構(gòu)相似性,包括它們獨特的鋅指分布規(guī)律,表明它們的功能是相近的[5]。

3.2 抑制細(xì)胞增殖 WIG-1分子中鋅指區(qū)域的發(fā)現(xiàn),提示其可能是一種核苷酸結(jié)合蛋白,但目前對其在p53依賴的生理反應(yīng)中所起的作用和機制仍知之甚少。小鼠與大鼠PAG608和人的WIG-1蛋白具有高度同源性,分別有97.9%和87%的氨基酸序列相同[13]。當(dāng)大鼠PAG608在人類腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)時,有較弱的促進(jìn)凋亡活性。這也提示W(wǎng)IG-1可能具有啟動細(xì)胞凋亡的功能。Issei等[14]進(jìn)行的克隆實驗結(jié)果表明,人WIG-1能夠顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖,其抑制率可達(dá)25%～30%。

有研究者認(rèn)為WIG-1可能與miRNA(microRNA)調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長和生存有關(guān),并且具有啟動p53誘導(dǎo)的細(xì)胞生長停滯和(或)誘導(dǎo)凋亡的作用,WIG-1與特殊的miRNA相結(jié)合能夠增加由miRNA和它的mRNA形成的有缺陷的小二重區(qū)域的穩(wěn)定性[11]。

在WIG-1啟動子中,幾個p53結(jié)合序列的存在反映了由p53和其家族成員p63、p73介導(dǎo)的是一個相當(dāng)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程。p63、p73和 p53一樣,能夠結(jié)合相同的序列并上調(diào)目前已知的幾種p53目的基因。p53以SP1或SP1相關(guān)蛋白作為一個共同因子,目的是達(dá)到p21和Bax啟動子的最大活化。在WIG-1啟動子中富含GC的區(qū)域也可以提供SP1結(jié)合位點[12],這與p53作用是非常類似的,但WIG-1是否能與p63及p73相結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮其功能尚有待進(jìn)一步研究。

WIG-1的mRNA在腦與睪丸組織中表達(dá)水平相似,而在肺、腎、脾臟經(jīng)過全身γ射線照射后表達(dá)上調(diào),其中原因有可能是γ射線照射能夠激活上述組織中p53的表達(dá)。WIG-1啟動子有兩個功能性的p53結(jié)合位點,使WIG-1可能具有p53依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能,這也證明了WIG-1是一種善意的p53目的基因[12]。WIG-1與核糖體RNA相結(jié)合能干擾核糖體的合成,從而導(dǎo)致蛋白復(fù)制的抑制以及生長抑制,并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡,因此可能起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[12]。

4 Cys2his2型鋅指蛋白的功能

鋅指蛋白是指含有通過結(jié)合Zn2+穩(wěn)定的短的可以自我折疊形成“手指”結(jié)構(gòu)的一類蛋白質(zhì),由于其自身的結(jié)構(gòu)特點,可以選擇性地結(jié)合特異的靶結(jié)構(gòu),使鋅指蛋白在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等生命過程中發(fā)揮重要作用。

根據(jù)鋅指結(jié)構(gòu)序列和功能的不同將其分為9大類,TFⅢA鋅指(Cys2his2),類固醇-甲狀腺素受體(Cys8),GAL4鋅指(Cys6),環(huán)狀鋅指(Cys3HisCys4),逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子(Cys2hisCys),LIM鋅指(Cys2hisCys5),GATA-1鋅指(Cys4),Nup475鋅指(Cys3His),requium 鋅指(Cys4HisCys3)。根據(jù)鋅指蛋白保守結(jié)構(gòu)域的差異,又可以將其分為C2h2型(Krüppel相關(guān)型)、C4型和C6型等 3個類群。根據(jù)鋅指的空間結(jié)構(gòu)來綜合分類,認(rèn)為每一種鋅指都可以在8組不同的折疊群中找到相應(yīng)的歸類,其分類為:類C2h2鋅指、高音譜號鋅指、鋼卷尺狀鋅指、箝口膨出狀鋅指、類Zn2PCys6鋅指、類 TAZ2鋅指、鋅結(jié)合短環(huán)鋅指、金屬硫蛋白鋅指[15]。

Cys2his2型鋅指蛋白的功能主要為兩個方面:調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄(即與核酸的相互作用)以及鋅指蛋白之間的相互作用。Cys2his2型鋅指蛋白能特異性地識別DNA,主要是由于其DNA結(jié)合域具有與DNA雙螺旋互補的特殊表面結(jié)構(gòu),依靠其指型空間結(jié)構(gòu)伸入到DNA雙螺旋的大溝內(nèi),通過α螺旋與DNA堿基發(fā)生特異性接觸[16]。另外,Cys2his2型鋅指不僅能與DNA發(fā)生相互作用,也可以識別 RNA,如TFⅢA既可以與5SrDNA結(jié)合,也可以與該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5SrRNA結(jié)合形成7S RNP復(fù)合物[16]。Cys2his2型鋅指蛋白還能與DNARNA雜交雙鏈分子的特異性結(jié)合。轉(zhuǎn)錄激活因子 SP1與WIG-1一樣同屬Cys2his2型鋅指蛋白,SP1主要通過調(diào)控富含GC啟動子的基因表達(dá),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能,如細(xì)胞增生、凋亡、分化和腫瘤形成。近年來的研究表明鋅指之間可以互相作用,鋅指與鋅指或鋅指蛋白與鋅指蛋白通過相互作用,能夠識別更多不同的DNA或阻止鋅指同DNA結(jié)合,進(jìn)一步發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用[17]。

5 小結(jié)與展望

以往研究證實,3q25～27區(qū)在包括肺鱗狀細(xì)胞癌、頭頸部鱗癌、宮頸癌、卵巢癌以及前列腺癌等多種人類惡性腫瘤中均存在異常擴增[5],眾多研究者相信在該區(qū)域極有可能篩選到可用于腫瘤基因診斷和治療的候選分子。WIG-1基因由于具有對細(xì)胞生長周期和凋亡的調(diào)控作用,加之其定位在3q25～27區(qū),使得研究者相信WIG-1有可能是潛在的候選腫瘤標(biāo)志物和基因治療靶點。由于研究時間尚短,WIG-1在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起的作用及其分子機制還有待進(jìn)一步研究。隨著對WIG-1功能及其機制了解的不斷深入,有望為p53介導(dǎo)的腫瘤抑制途徑研究領(lǐng)域帶來新的觀點和突破。

[1] Barkic M,Crnomarkovi S,Grabusic K,et al.The p53 tumor suppressor causes congenital malformations in Rpl24-deficient mice and promotes their survival[J].Mol Cell Biol,2009,29(10):2489.

[2] Sykes SM,Mellert HS,Holbert MA,et al.Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction[J].Mol Cell,2006,24(6):841.

[3] Leone M,Zhai D,Sareth S,et al.Cancer prevention by tea polyphenols is linked to their direct inhibition of antiapoptotic bcl-2-family proteins[J].Cancer Res,2003,63(23):8118.

[4] Kim E,Deppert W.Transcriptional activities of mutant p53:when mutations are more than a loss[J].J Cell Biochem,2004,93(5):878.

[5] Cristina M V,Magdalena P,Klas G,et al.The p53-induced WIG-1 protein binds double-stranded RNAs with structural characteristics of siRNAs and miRNAs[J].FEBS Letters,2006,580(18):4401.

[6] Llorenc CM,Daniel IS,Antonio FS,et al.MDM2 antagonists activate p53 and synergize with genotoxic drugs in B-cell chronic lymphocytic leukemia cells[J].Blood,2006,107(10):4109.

[7] Garnett KE,Chapman P,Chambers JA,et al.Differential gene expression between Zucker Fatty rats and Zucker Diabetic Fatty rats:a potential role for the immediate-early gene Egr-1 in regulation of beta cell proliferation[J].J Mol Endocrinol,2005,35(1):13.

[8] Crown Human Genome Center,Department of Molecular Genetics,the Weizmann Institute of Science.Zinc finger,matrin type 3[DB/OL].1996(2010-1-11)[2010-2-23].http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=Zmat3.

[9] Hellborg F,Wiman KG.The p53-induced WIG-1 zinc finger protein is highly conserved from fish to man[J].Int J Oncol,2004,24(6):1559.

[10]Mendez VC,Wilhelm MT,Hellborg F,et al.The p53-induced mouse zinc finger protein WIG-1 binds doublestranded RNA with high affinity[J].Nucleic Acids Res,2002,30(9):1991.

[11]Xi Y,Edwards JR,Ju J.Investigation of miRNA biology by bioinformatic tools and impact of miRNAs in colorectal cancer-regulatory relationship of c-myc and p53 with miRNAs[J].Cancer Inform,2007,31(3):245.

[12]Wilhelm MT,M endez Vidal C,Wiman KG.Identification of functional p53-binding motifs in the mouse wig-1 promoter[J].FEBS Lett,2002,524(1):69.

[13]Higashi YA,Sanuma MM,Iyazaki I,et al.The p53-activated gene,PAG608,requires a zinc finger domain for nuclear localization and oxidative stress-induced apoptosis[J].J Biol Chem,2002,277(44):42224.

[14]Issei I,Yasuhiro Y,Itaru S,et al.Identification of ZASC1 Encoding a Krǖppel-like Zinc Finger Protein as a Novel Target for 3q26 Amplification in Esophageal Squamous Cell Carcinomas[J].Cancer Res,2003,63(15):5691.

[15]MacPherson S,Larochelle M,Turcotte B.A fungal family of transcriptional regulators:the zinc cluster proteins[J].Microbiol Mol Biol Rev,2006,70(3):583.

[16] Benjamin L.GeneⅧ[D].Oxford:Oxford University Press,2000:654.

[17]O′Farrell TJ,Ghosh P,Dobashi N,et al.Comparison of the effect of mutant and wild-type p53 on global gene expression[J].Cancer Res,2004,64(22):8199.