環(huán)形LED 陣列光源顯微成像系統(tǒng)設(shè)計

馬驍 顏曉萌

（廣東交通職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510650）

1 概述

雖然有許多先進(jìn)的顯微成像設(shè)備被發(fā)明，例如電子顯微鏡、原子力顯微鏡、熒光顯微鏡等，傳統(tǒng)的明場光學(xué)顯微鏡仍舊是生命科學(xué)、材料學(xué)等領(lǐng)域不可替代的基本工具之一[1-4]。明場光學(xué)顯微鏡由照明光源、成像透鏡組，以及載物臺等部分組成。其中照明一般采用柯勒照明方式[1-4]，照明光由鹵素?zé)暨@類熱光光源加熱燈絲產(chǎn)生。熱光光源雖然具有發(fā)光光譜寬、照明亮度高等優(yōu)勢，但也存在光能轉(zhuǎn)化效率低，使用壽命短，需要散熱等缺點。而且，熱光光源燈絲要保證照明亮度，通常制成特定的彎曲形狀增大發(fā)光面積，只有使用復(fù)雜的光路，才能實現(xiàn)均勻的照明。相比之下，發(fā)光二極管（LED，Light emitting diode，LED）具有更高的發(fā)光效率，單色性好等優(yōu)點，而且LED 本身具有聚光鏡結(jié)構(gòu)，LED 芯片發(fā)出光線經(jīng)過聚光鏡，可形成發(fā)散角較小的光束，當(dāng)與樣品距離遠(yuǎn)大于樣品的尺寸時，照射在樣品上的光束可近似看作平行光，無需復(fù)雜的光路，也可以提供均勻且高亮的樣品照明，因此，LED 正逐漸取代傳統(tǒng)照明光源，在顯微成像領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[5-9]。此外，單顆LED 體積較小，便于各種形式排布，實現(xiàn)各種入射角的調(diào)制照明，這是其他光源難以做到的。

本文根據(jù)顯微鏡成像系統(tǒng)特點，結(jié)合環(huán)形LED 陣列光源，給出了一套顯微成像系統(tǒng)設(shè)計思路，并列舉出了該裝置的使用實例，例如、差分相位顯微成像[10,11]、暗場成像[12]。

2 顯微成像系統(tǒng)設(shè)計

由于環(huán)形LED 陣列光源顯微成像系統(tǒng)，可以實現(xiàn)光場顯微成像、差分相位顯微成像、暗場顯微成像，需要對樣品進(jìn)行軸向掃描拍攝。下面給出了一種實現(xiàn)軸向掃描自動化拍攝的顯微成像系統(tǒng)設(shè)計方案，該系統(tǒng)將包括硬件設(shè)計和軟件設(shè)計兩部分。在軟件的編程控制下，實現(xiàn)自動化的顯微成像拍攝。

2.1 硬件設(shè)計

在顯微成像系統(tǒng)中環(huán)形LED 陣列光源被放置在樣品正下方，其所在平面垂直于光軸，光軸穿過環(huán)形LED 陣列光源中心，LED指向決定照明數(shù)值孔徑，要求與當(dāng)前顯微物鏡數(shù)值孔徑一致，與不同數(shù)值孔徑的物鏡匹配可采用多種環(huán)LED 陣列光源，根據(jù)需要控制其點亮環(huán)與所使用的物鏡照明數(shù)值孔徑匹配。成像系統(tǒng)中，所使用的無限遠(yuǎn)顯微系統(tǒng)由物鏡和管鏡構(gòu)成，通過物鏡的光線在物鏡后不直接成像，而是形成平行光束，進(jìn)入管鏡，在管鏡一倍焦距附成像，成像探測器感光面與管鏡后焦面重合。

為了便于自動對焦、尋找感興趣區(qū)域，以及軸向掃描完成三維測量，機械樣品位移臺由一個長程二維水平X-Y 位移裝置和一個長程高精度Z 軸向位移臺組成，樣品托架被固定在位移臺頂端，位于環(huán)形LED 陣列光源正上方。二維水平X-Y 位移裝置的作用是在水平方向大范圍調(diào)整樣品位置，便于尋找感興趣區(qū)域，而Z 軸向位移臺帶動樣品托架，實現(xiàn)高精度光軸z 方向調(diào)節(jié)，實現(xiàn)自動對焦并獲取樣品不同層的顯微圖像。樣品托架用于固定待測樣品。

2.2 軟件設(shè)計

軟件部分由拍攝準(zhǔn)備程序段和拍攝程序段兩部分構(gòu)成。準(zhǔn)備程序包括光源初始化程序、位移臺初始化程序和相機初始化程序，在選擇成像模式時自動開啟。圖2 是拍攝程序設(shè)計流程圖。

初始化程序段是為了計算機與檢測硬件間的通信狀態(tài)，一般相機初始化程序較復(fù)雜，因此一般先從檢測相機的初始化，調(diào)試順利執(zhí)行后，再進(jìn)行其他初始化操作。

3 環(huán)形LED 陣列光源顯微成像實驗

采用上述設(shè)計方案可以實現(xiàn)多種成像模式，且可以應(yīng)用不用倍數(shù)物鏡，這里分別采用100 倍物鏡和20 倍物鏡分別進(jìn)行實驗，驗證設(shè)計方案的可行性。

3.1 差分相襯顯微成像

實驗中采用的環(huán)形LED 陣列光源如圖3 所示。

該光源由60 顆參數(shù)完全相同的LED 燈珠等間隔排列在環(huán)形內(nèi)面，外徑176 mm，內(nèi)徑140 mm，整體厚度15 mm，發(fā)光功率24 W，外殼采用鋁合金材質(zhì)，便于散熱。光源發(fā)光中心波長520 nm，帶寬10 nm，該光源被放在下樣品正下方，光源面與樣品平面平行，光軸經(jīng)過光源中心，入射角為～64°，計算得到照明數(shù)值孔徑NA=0.9。剛好與尼康100 倍（平場消色差物鏡，NA=1.25）顯微物鏡數(shù)值孔徑匹配。

無限遠(yuǎn)顯微成像光學(xué)系統(tǒng)使用一臺標(biāo)準(zhǔn)透射式的明場顯微鏡（Nikon 80-i）機架來搭建。使用高速灰度CMOS 相機（Andor，Zyla 4.2P）對樣品進(jìn)行拍攝。

機械樣品位移臺中樣品托架采用懸臂式結(jié)構(gòu)如圖2 所示，樣品被固定在一端，為保證水平需要在另一端調(diào)整配重，保證z軸位移臺受力平衡。樣品托架選擇重量輕、機械強度高的鈦合金作為制作材料。高精度z 軸向位移臺使用納米級z 軸位移臺（PIHeraPiezo Linear Stage，P-621.1CD），閉環(huán)總調(diào)節(jié)范圍100 μm，精度0.4 nm。樣品為未染色的硅藻固定裝片。

設(shè)置拍攝位置，照明模式按照上半環(huán)LED 燈點亮，拍攝得到圖像I1 如圖4（a）所示，上半環(huán)LED 燈熄滅，下半環(huán)LED 燈點亮，拍攝圖像得到圖像I2如圖4（b）所示，根據(jù)公式差分相襯顯微圖像Id=（I1-I2）/（I1+I2），計算出差分相襯顯微圖像如圖4（c）所示，可以看到經(jīng)過計算后的圖像中硅藻結(jié)構(gòu)更加清晰了。

圖4 光場顯微成像圖像

圖5 草履蟲暗場顯微圖像

3.2 暗場顯微成像

實驗中采用的環(huán)形LED 陣列光源、無限遠(yuǎn)顯微成像光學(xué)系統(tǒng)、機械樣品位移臺與3.1 節(jié)差分相襯顯微成像實驗中完全相同，為實現(xiàn)暗場成像，采用20 倍尼康物鏡（平場消色差物鏡，NA=0.4）。設(shè)置拍攝位置，照明開啟全部LED 燈進(jìn)行拍攝，樣品為未染色的草履蟲固定裝片。

4 結(jié)論

本文簡要介紹了一種基于環(huán)形LED 陣列光源搭建的顯微成像系統(tǒng)，并根據(jù)設(shè)計方案搭建了實驗成像系統(tǒng)，拍攝了兩種模式的成像結(jié)果，驗證了設(shè)計方案的可行性。