飼用植酸酶的研究進展

馬俊孝

植酸的化學名稱為肌醇六磷酸酯（myo-inositol hexakisdihydrogen phoshate），即環(huán)己六醇的六磷脂，幾乎不以游離形式存在，一般是以其鈣、鎂、鉀、鈉、鐵等金屬離子結(jié)合形成復(fù)合物，這些復(fù)合物不溶于水，不能被消化吸收，還能螯合蛋白分子，降低蛋白質(zhì)的生物效價和消化率，是一種廣譜性的抗營養(yǎng)因子。玉米、豆餅粕、谷糠、棉籽餅粕等是畜禽飼料的主要來源，其中所含的磷40%～70%以植酸磷的形式存在。單胃動物消化道內(nèi)缺乏分解消化植酸的酶，一方面飼料中需要補充無機磷；另一方面飼料中大量的植酸磷不能被利用而隨糞便排入環(huán)境，既浪費了資源，又對環(huán)境造成了污染。植酸酶是一種能水解植酸的酶類，在提高磷的利用率、減少糞便中有機磷的排放以及降低飼料成本方面的效果已被廣泛證實[1-2]。因此，植酸酶的研究與開發(fā)具有重要的理論與實踐意義。植酸酶在天然材料中的產(chǎn)量很低，酶的耐熱性不能完全滿足飼料的加工過程，酶在動物消化道環(huán)境中的穩(wěn)定性也亟待提高。近年來，應(yīng)用分子生物學手段對這些問題進行了大量的研究并取得了一系列成果，本文介紹了這方面的研究進展。

1 植酸酶的來源

植酸酶在自然界的分布很廣泛。小麥、大豆、玉米、大麥、番茄以及百合等多種植物都能產(chǎn)植酸酶，但只有少數(shù)的植物植酸酶被分離純化并進行了酶學性質(zhì)研究。自然界里許多微生物都可以產(chǎn)生植酸酶，已陸續(xù)從細菌、真菌及酵母等多種微生物中分離得到植酸酶，其中植酸酶產(chǎn)量最高的是真菌，其產(chǎn)生的植酸酶有pH值范圍廣、活性高等優(yōu)點，是生產(chǎn)商品植酸酶的主要來源[3-4]。動物源的植酸酶存在于哺乳動物的小腸及脊椎動物的紅血球中，此外，牛等反芻動物的瘤胃中植酸酶活性較高，這可能是瘤胃中的微生物可以產(chǎn)生植酸酶的緣故。動物來源的植酸酶含量少且活性低，很難進行分離純化和性質(zhì)分析，因此，人們對動物來源的植酸酶研究較少。

2 植酸酶的生物學特性

植物植酸酶活性的最佳pH值范圍窄，不適合在單胃畜禽酸性的胃中起作用[5]，最適溫度在47～62℃[6]。植物植酸酶分子量變化較大，分子量較小的有米糠植酸酶，為47 kD；分子量較大有綠豆植酸酶，達158 kD。

微生物來源的植酸酶，其性質(zhì)因產(chǎn)酶菌種不同而存在差異。最適pH值范圍較寬，一般在2.5～6.0，有的菌株所產(chǎn)的酶具有兩個最適pH值峰值，比較適合單胃畜禽的胃腸道環(huán)境。比如無花果曲霉（Aspergillu ficuum NRRL3135）的植酸酶，它的最適pH值為2.5和5.5[7]。分離自百合（Lilium longiflorum）的植酸酶，其最適pH值為7.3～8.3，它是迄今發(fā)現(xiàn)的極少數(shù)的堿性植酸酶之一[8]。大部分微生物植酸酶的最適溫度都集中在40～70℃之間，微生物植酸酶因來源不同分子量也有差異。

3 植酸酶基因

目前克隆到的植酸酶基因主要有：真菌來源的phyA(B)基因、芽孢桿菌來源的phyC(L)基因、大腸桿菌來源的appA基因、其它微生物來源及動植物來源植酸酶基因。

對植酸酶基因研究較多的是來源于真菌的phyA(B)基因，表達產(chǎn)物幾乎全為酸性植酸酶。Van Hartingsveldt等（1993）首次報道了來自A.ficuum NRRL3135的植酸酶基因phyA[9]，該基因全長1 506 bp，其中+46～+147的102 bp的核苷酸序列是一個典型的真菌內(nèi)含子，具有真菌內(nèi)含子的特征保守序列。phyA基因編碼467個氨基酸，有數(shù)目不等的潛在的糖基化位點，N端的19個氨基酸為信號肽。phyA編碼的氨基酸序列上存在組氨酸酸性磷酸酶的活性位點保守序列，可歸為組氨酸酸性磷酸酶這一家族。phyA基因中G+C含量達68.3%，這是絲狀真菌中表達蛋白編碼序列所具有的特征之一，無論是在核苷酸來源及所編碼的氨基酸的序列還是在基因產(chǎn)物的酶學特征上均具有較高的同源性。同年，Ehrlich等分離克隆來自A.ficuum的第二個植酸酶基因phyB，phyB與phyA的核苷酸序列及所編碼的氨基酸序列同源性低，但表達的蛋白屬組氨酸酸性磷酸酶家族，氨基酸序列上也有活性位點保守序列，phyB基因全長1 605 bp，共編碼479個氨基酸，其上至少有8個糖基化位點，phyB編碼的植酸酶最適pH值為2.5，而phyA植酸酶的最適pH值為5.0[10]。

來源于細菌（主要是芽孢桿菌，Bacillus subtilis）的植酸酶多為中性植酸酶，沒有組氨酸酸性磷酸酶的活性位點保守序列，基因較短，與已報道的phyA及phyB同源性低，不屬于組氨酸酸性磷酸酶家族。Kerovuo等（1998）首次從B.subtilis VTT E-68013中分離出植酸酶基因phyC，該基因全長1 152 bp，編碼383個氨基酸，其中N末端的26個氨基酸是信號肽序列[11]。各種芽孢桿菌植酸酶的酶學性質(zhì)基本一致，具有相近的分子量和等電點，都具有較好的熱穩(wěn)定性和相近的最適pH值范圍。

來源于大腸桿菌的植酸酶(appA植酸酶)是一種雙功能酶，在酸性條件下既表現(xiàn)出磷酸酶的活性又表現(xiàn)出植酸酶的活性。appA植酸酶是迄今所知的分解植酸能力最強的植酸酶[12]，也是迄今所報道的比活性最高的植酸酶[13-14]。Greiner等（1993）從 E.coli中克隆得到植酸酶基因appA，appA是一個編碼雙功能蛋白基因，全長1 299 bp，編碼432個氨基酸，N末端22個氨基酸為信號肽。按成熟蛋白的氨基酸推斷，其理論分子量為45.7 kDa，有2個潛在的糖基化位點，氨基酸序列上存在活性位點保守序列[15]。

Huang等（2006）從中間型耶氏菌（Yersinia intermedia）中克隆得到一個新的植酸酶基因，該酶基因全長1 326 bp，編碼441個氨基酸，氨基酸序列上存在活性位點保守序列，N末端23個氨基酸為信號肽，與腸桿菌、絲狀真菌來源的植酸酶在空間結(jié)構(gòu)上基本一致[16]。反芻動物能有效利用植酸磷，與瘤胃中的微生物產(chǎn)植酸酶有關(guān)，目前已經(jīng)分離到多種產(chǎn)植酸酶的瘤胃微生物[17]。

植物中最早分離出來的植酸酶基因是來自玉米的phyS11，是Maugenset等于1997年從萌發(fā)的玉米種子中分離得到的，該基因全長1 167 bp，編碼388個氨基酸，它所編碼的氨基酸序列與絲狀真菌只有33個氨基酸同源序列，其中有活性位點保守序列存在[18]。

4 植酸酶基因工程

4.1 在微生物中的表達

4.1.1 在大腸桿菌中的表達

在原核生物中表達外源基因研究最多的是大腸桿菌。Phyillippy等(1997)將Aspergillus niger的植酸酶基因phyA克隆到大腸桿菌中，表達出了沒有被糖基化并且沒有活性的胞內(nèi)蛋白，在體外其活性只有天然植酸酶活性的1%[19]。姚斌等（2001）將來源于B.subtilis的植酸酶基因在大腸桿菌中進行了表達，得到了大小約為40 kD的蛋白，具有正常的生物學活性，但酶活不到理論值的5%[20]。上述研究獲得的表達水平還很低，大腸桿菌中表達的植酸酶無轉(zhuǎn)錄后修飾，主要以包涵體的形式存在，沒有酶活性，因此不適于植酸酶基因的表達。黃敏等（2009）將大腸桿菌植酸酶appA基因重組于表達載體pET32a中，導(dǎo)入大腸桿菌Origami(DE3)，該酶的比活力高達 3.36×106U/mg，具有非常好的抗胃蛋白酶水解的能力和部分抗胰蛋白酶水解的能力[14]。

4.1.2 畢赤酵母中的表達

畢赤酵母表達系統(tǒng)在技術(shù)上非常成熟，表達異源蛋白時具有諸多的優(yōu)點，已成功表達了幾十種蛋白。近年來，植酸酶基因在畢赤酵母中的表達取得了可喜的成績。姚斌等（1998）對來源于Aspergillus niger 963的植酸酶基因phyA2進行了改造，然后融合到畢赤酵母高效表達載體pPIC9并轉(zhuǎn)化畢赤酵母（P.pastoris GS115），表達量比原菌株高約3 000倍，表達產(chǎn)物具有正常的生物學活性[21]。Chen等（2004）通過優(yōu)化培養(yǎng)基，在宿主甲基營養(yǎng)型畢赤酵母（P.pastoris KM71）中表達了來自大腸桿菌的植酸酶基因appA，酶的表達量提高了16～24倍[22]。

4.1.3 在其它微生物中的表達

Berka等(1998)對來源于耐熱真菌高溫疏綿毛菌的編碼胞外植酸酶的phyA基因在鐮刀菌中實現(xiàn)異源表達，表達的重組酶蛋白具有廣泛的pH值范圍，在pH值3.0～7.5內(nèi)都有催化活性，在75℃仍保持酶活，在65℃（最適溫度）時表現(xiàn)出非常優(yōu)越的催化效率[23]。在枯草芽孢桿菌中已經(jīng)建立了一個大規(guī)模表達植酸酶的高效的表達系統(tǒng)[24]。此外，在釀酒酵母[25]、乳酸菌[26-27]中成功表達了有活性的植酸酶。

4.2 在植物中的表達

轉(zhuǎn)基因作物除了提供人類賴以生存的糧食和衣料等以外，還能產(chǎn)生各種重要物質(zhì)。過去只能用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)植酸酶，如果在一些植物性飼料（如玉米、大麥、大豆等）能累積足量的植酸酶，無疑是一條生產(chǎn)植酸酶的途徑。近年來研究人員致力于將植酸酶基因?qū)胫参镏械难芯浚@得了成功。目前，已在煙草[28]、大豆[29]、油菜[30]和水稻[31]等轉(zhuǎn)基因植物中表達出植酸酶，有些酶能抵制胃蛋白酶的降解，而且也有一定水平的表達量，有著大規(guī)模生產(chǎn)的潛力。

4.3 在動物中的表達

目前，還有將E.coli的植酸酶基因（appA）導(dǎo)入小鼠唾液腺，使該酶基因在小鼠唾液腺中高效表達，以此作為控制環(huán)境污染的模式，結(jié)果表明，在唾液腺中植酸酶的表達能使小鼠糞便中磷的排泄量減少11%[32]。王文兵等（2003）將從A.niger 963克隆并改造后的植酸酶基因在家蠶-桿狀病毒系統(tǒng)中進行了表達，在家蠶的蠶體和蠶蛹中表達活性分別為4.67×105U/ml血淋巴液和5.997×105U/ml血淋巴液，酶活性的最適溫度范圍是50～60℃，最適pH值為5.5～5.0和2.5[33]。

5 植酸酶基因工程研究的應(yīng)用

5.1 提高酶的表達量

植酸酶的自然產(chǎn)生菌株表達量低,難以大規(guī)模低成本地生產(chǎn)植酸酶,采用基因工程手段可以提高酶的表達量。姚斌等（1998）構(gòu)建的植酸酶的高效表達菌株，產(chǎn)量是出發(fā)菌株產(chǎn)量的3 000倍[21]。Kim等（1999）將帶有來自于芽孢桿菌天然啟動子的植酸酶基因克隆到芽孢桿菌表達載體pJH27強啟動子BJ27的下游，在芽孢桿菌胞外分泌表達量為出發(fā)菌株產(chǎn)量的100倍[34]。Kerovuo等（2000）運用了一種新的芽孢桿菌表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)與磷酸鹽運輸相關(guān)的pst操縱子對磷酸饑餓反應(yīng)具有強烈的誘導(dǎo)作用。作為磷酸饑餓的結(jié)果，由pst啟動子引發(fā)的表達可被誘導(dǎo)至5 000倍以上[35]。

5.2 改善酶的熱穩(wěn)定性

目前，通過基因工程菌微生物發(fā)酵來大規(guī)模廉價生產(chǎn)飼料用植酸酶已基本得到解決，但植酸酶在應(yīng)用上的另一個關(guān)鍵問題始終沒有得到解決，即酶的熱穩(wěn)定性。加工飼料都需要一個短暫的高溫制粒過程，用于飼料的植酸酶必須具有良好的耐熱性。對植酸酶的基因在分子水平上進行改造有利于改善植酸酶的熱穩(wěn)定性。

有研究表明，糖基化修飾對于植酸酶耐熱性的提高是有作用的。Han等（1999）把A.niger的phyA基因在畢赤酵母中表達，得到的新植酸酶最適作用溫度比原來提高了2℃[36]。

通過酶結(jié)構(gòu)延伸（在酶蛋白的C末端增加一段氨基酸序列來擴展蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)）改變蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，可以達到改善酶理化性質(zhì)的目的。陳惠等將來源于黑曲霉N25的植酸酶基因重組于大腸桿菌表達載體，經(jīng)PCR擴增獲得結(jié)構(gòu)延伸突變植酸酶基因（在植酸酶基因C端增加了來源于載體上的13氨基酸殘基），重組基因在GS115酵母中表達，與野生型酶相比最適反應(yīng)溫度上升了3℃，75℃處理10 min后熱穩(wěn)定性提高21%[37]。

采用基因突變技術(shù)，改變酶活性基團DNA序列，從而改變酶蛋白的抗熱性。Garrett等運用基因位點飽和突變技術(shù) (gene site saturation mutagenesis,GSSM)將來源于E.coli植酸酶基因appA進行突變，突變株的Tm值比原酶高出12℃[38]。

5.3 改良酶的最適pH值

要使植酸酶能在畜禽體內(nèi)產(chǎn)生有效的催化作用，要求飼用酶對聲值有較大的適應(yīng)范圍pH值。采用基因突變技術(shù)可以改變酶的最適pH值。Andrea等(2002)通過定點突變改變真菌和同序植酸酶的pH值范圍，突變株產(chǎn)生第2個最適pH值（在2.8～2.4）。另外，在同序植酸酶和A.fumigatus中進行突變后最適pH值降低0.5～1.0單位，而酶的比活力沒有明顯變化[39]。通過酶結(jié)構(gòu)延伸還可以改善酶的有效pH值范圍，陳惠等（2005）將來源于黑曲霉N25的植酸酶基因經(jīng)結(jié)構(gòu)延伸突變在酵母中表達，與野生型酶相比有效pH值范圍擴大了0.4個單位[37]。

5.4 提高植酸酶對蛋白酶抗性

植酸酶主要的作用場所是動物的胃腸道，因此優(yōu)良的酶應(yīng)該對胃蛋白酶和胰蛋白酶有一定的抗性。酶分子易被蛋白酶降解，原因是在酶分子表面存在蛋白酶的作用位點，利用突變技術(shù)將這些位點改變，則可能提高酶分子的抗性能力。Wyss等（1999）對來源于A.fumigatus植酸酶進行突變，通過結(jié)構(gòu)分析確定酶分子表面的兩個位點進行突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變S152N、S152N/R151L可以提高抗蛋白酶降解能力而不會影響比活性[40]。James等（2001）運用基因突變技術(shù)使突變株植酸酶的腸道環(huán)境耐受性提高了35%[41]。

6 展望

用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)改造和提升植酸酶產(chǎn)業(yè)已成為植酸酶產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展方向，必將進一步提升植酸酶的性能和使用范圍。它不僅符合國家產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要方向，同時也是各生產(chǎn)企業(yè)提高產(chǎn)品競爭力和取勝的關(guān)鍵。目前已在乳酸菌[26-27]、芽孢桿菌[24-25]、凝結(jié)芽孢桿菌[42]等用于微生態(tài)產(chǎn)品的菌株中表達了植酸酶，如果實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，將集植酸酶和微生態(tài)產(chǎn)品兩種效果于一身，具有極大的實際意義。飼料作物的植酸酶轉(zhuǎn)基因工程也已取得一定進展，由中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所培育的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準，已于2009年8月發(fā)放了生產(chǎn)應(yīng)用安全證書。已在大豆[29]中表達了植酸酶，如果能在更多飼用植物中表達植酸酶并提高其產(chǎn)量和耐溫性，將具有巨大的應(yīng)用和商業(yè)價值。此外，隨著動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，植酸酶轉(zhuǎn)基因動物研究也已展開。盡管采用多種分子生物學手段來改善植酸酶的耐溫、產(chǎn)量、腸道環(huán)境抗性等問題，但是一種廣適酶的開發(fā)仍然是懸而未決的課題，這方面的研究仍將繼續(xù)開展。

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