羽毛角蛋白降解的研究進(jìn)展

王巍杰 程紅燕 楊永強(qiáng)

動(dòng)物的大量消費(fèi)產(chǎn)生許多羽毛廢棄物，傳統(tǒng)處理方法主要為填埋、焚燒和產(chǎn)氣，對(duì)環(huán)境造成很大危害。利用家禽羽毛制備動(dòng)物飼料的研究較早，已經(jīng)取得一定規(guī)模的應(yīng)用發(fā)展，但羽毛中90%的角蛋白未被高效利用，造成可利用資源的浪費(fèi)。角蛋白作為羽毛的主要成分，已經(jīng)應(yīng)用于化妝品行業(yè)，或作為復(fù)合材料、纖維制品的組分被利用。角蛋白因大量二硫鍵的交聯(lián)成為復(fù)雜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有良好的穩(wěn)定性和難溶性，一般方法很難將其水解，由此引發(fā)羽毛降解方法的研究熱潮。目前常用途徑有物理降解法、化學(xué)降解法和角蛋白酶降解法。盡管物理、化學(xué)方法研究較早，但存在破壞氨基酸結(jié)構(gòu)、產(chǎn)物單一以及產(chǎn)物穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。酶法反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小，降解產(chǎn)物完整多樣，具有應(yīng)用前景。酶法降解涉及到產(chǎn)酶菌的篩選，酶的分離鑒定和羽毛降解等過程。

1 角蛋白結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

角蛋白是中間絲超家族的重要成員，以α-螺旋和β-折疊進(jìn)一步構(gòu)成超螺旋多肽鏈，內(nèi)部的半胱氨酸二硫鍵作為連接橋形成復(fù)雜的交聯(lián)網(wǎng)。1930年，Aatbury和他的同事利用高角度的X射線衍射研究角蛋白的分子結(jié)構(gòu)，提出蛋白質(zhì)肽鏈?zhǔn)钦郫B的，隨后發(fā)現(xiàn)這種折疊就是α-螺旋。他們將羊毛拉伸至原長(zhǎng)2倍后發(fā)現(xiàn)，角蛋白變?yōu)棣?折疊模式的裝配。三維結(jié)構(gòu)的分析顯示，角蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和β-折疊，β-折疊的形成和相互作用對(duì)于角蛋白的裝配起著重要作用。根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成將角蛋白分為α-角蛋白和β-角蛋白。其中，α-角蛋白多見于脊椎動(dòng)物上皮，富含大量半胱氨酸殘基，二級(jí)結(jié)構(gòu)則由大量α-螺旋構(gòu)成，分子量為40～70 kDa。β-角蛋白分子量要小很多，在10～20 kDa范圍，富含小側(cè)鏈甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸殘基，二級(jí)結(jié)構(gòu)幾乎都由β-折疊的片層結(jié)構(gòu)組成，也是角蛋白穩(wěn)定性高的重要原因。羽毛角蛋白主要為β-角蛋白，通過二硫鍵使各條肽鏈相互交聯(lián)，具有良好的穩(wěn)定性且不易被降解。

角蛋白強(qiáng)度與尼龍相當(dāng)，其內(nèi)部的交聯(lián)網(wǎng)徑要小于木材纖維。角蛋白的性質(zhì)與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，它不被胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶降解的原因是具有能抵抗特異性蛋白酶活性的長(zhǎng)聚合鏈。角蛋白難溶和難降解的抗性不僅取決于聚合肽的超螺旋結(jié)構(gòu)，還由于半胱氨酸形成的二硫鍵和其它分子相互作用使蛋白機(jī)械強(qiáng)度提高。角蛋白的反應(yīng)活性位點(diǎn)是酰胺鍵、羧基和亞砜基等，當(dāng)角蛋白濃度很低時(shí)，角蛋白分子傾向于形成分子內(nèi)二硫鍵，使肽鏈不能通過分子間二硫鍵交聯(lián)成網(wǎng)，這提示我們可通過控制角蛋白肽鏈的交聯(lián)程度改變其難降解的性質(zhì)。

2 羽毛降解生產(chǎn)角蛋白及類似物

2.1 物理方法

物理法也叫機(jī)械法，原理是利用特殊溫度、壓力條件使羽毛水解為可溶性多肽或寡肽混合物，高壓蒸汽可增加角蛋白的溶解性。該法工藝流程簡(jiǎn)單，將羽毛除雜、投入反應(yīng)器后通入蒸汽，得到塊狀蛋白產(chǎn)物后烘干粉碎便可作為動(dòng)物飼料。近幾年發(fā)現(xiàn)，微波法也可用于廢棄羽毛的降解，較傳統(tǒng)物理法有更高的產(chǎn)率，但產(chǎn)物單一，多為復(fù)合氨基酸，且研究尚處在實(shí)驗(yàn)室階段。物理方法多會(huì)破壞氨基酸分子鍵，產(chǎn)物穩(wěn)定性差，若作為動(dòng)物飼料，得到的蛋白粉口味較差，消化率低，限制了物理法的應(yīng)用范圍。

2.2 化學(xué)方法

化學(xué)法利用酸、堿或氧化還原劑使羽毛中的角蛋白降解為可溶性蛋白、多肽或游離氨基酸。Kelly等利用Ca(OH)2處理雞羽毛生產(chǎn)動(dòng)物飼料，反應(yīng)溫度在150℃，羽毛角蛋白25 min內(nèi)溶解80%，反應(yīng)后經(jīng)碳酸化可回收54%的鈣劑。利用NaOH的堿水解法可產(chǎn)生多種不同肽鏈，增加酰胺鍵和亞砜含量能改變角蛋白的化學(xué)性質(zhì)，堿溶液在65℃反應(yīng)，2～5 h內(nèi)可提出68%～82%的水溶性角蛋白，富含中間纖維和中間纖維絲成分，若將NaOH與Na2S聯(lián)合溶解羽毛，40℃便能提取出角蛋白。氧化還原劑的使用也可降解羽毛，水、甘油和亞硫酸鈉的組合可降解羽毛產(chǎn)生液體角蛋白，而巰基乙酸等物質(zhì)的預(yù)處理可有效破壞二硫鍵。Schrooyen等選用2-巰基乙醇和尿素共同降解雞羽毛，尿素起蛋白質(zhì)溶脹作用，采用滲析除去巰基乙醇和尿素后發(fā)現(xiàn)，角蛋白多肽出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，并且半胱氨酸殘留物氧化形成凝膠，影響了角蛋白溶液的穩(wěn)定性。改變實(shí)驗(yàn)條件發(fā)現(xiàn)在滲析前加入十二烷基硫酸鈉（SDS）可阻止多肽鏈的聚集。但堿法效率不高，產(chǎn)物主要為多肽；酸法會(huì)腐蝕設(shè)備、污染環(huán)境，且復(fù)合氨基酸產(chǎn)率不高。酸堿的聯(lián)合水解是今后的研究方向。

2.3 角蛋白酶降解法

角蛋白是一種不溶性蛋白，其良好的穩(wěn)定性是因?yàn)榘腚装彼嵝纬傻拇罅慷蜴I使肽鏈相互交聯(lián)，選擇降解方法很關(guān)鍵。堿水解法或機(jī)械處理會(huì)破壞氨基酸內(nèi)部結(jié)構(gòu)，同時(shí)消耗大量能量。較好的選擇是利用特異性蛋白酶將羽毛水解。角蛋白酶的應(yīng)用十分廣泛，可用作羽毛、毛發(fā)和膠原蛋白等物質(zhì)的降解，具有高效的脫毛性；還可降解朊蛋白，用于洗滌劑和熱處理工藝。角蛋白酶可從多種真菌和細(xì)菌的培養(yǎng)中得到，酶的來源日趨豐富。

2.3.1 產(chǎn)酶菌的篩選

角蛋白酶的活性取決于生產(chǎn)它的微生物，從芽孢桿菌(Bacillus sp)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和假單胞菌（Pseudomonas）等多種細(xì)菌或真菌都已分離出角蛋白酶，部分角蛋白酶只具有降解某些氨基酸的活性，比如在多種微生物中被分離的絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。產(chǎn)酶菌的培養(yǎng)須有羽毛作為底物，將土壤樣品與底物混合放至無菌培養(yǎng)皿中，在28℃下培養(yǎng)，并添加氯霉素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，沙式瓊脂或燕麥膳食瓊脂的使用可用于產(chǎn)酶菌的純化和鑒定。

在各種微生物中，尤以芽孢桿菌或地衣芽胞桿菌分離出的角蛋白酶最多，發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分得到了進(jìn)一步優(yōu)化，酶最適pH值為8溫度為50℃，但酶活性會(huì)被EDTA顯著抑制。最近，Kublanov等以100 mg/l蔗糖、200 mg/l酵母提取物、1 mg/l維生素、1 g/l蛋白胨和2 g/l豬毛為培養(yǎng)基培養(yǎng)一種少見嗜熱厭氧菌，4 d后分離出分子量為150 kDa的罕見絲氨酸蛋白酶，并對(duì)酶水解活性進(jìn)行了表征。

2.3.2 酶活性的鑒定

最初篩選的菌株合成酶可能只具有降解角蛋白部分組分的活性，需要對(duì)酶活性進(jìn)行表征鑒定。先利用膜超濾，羥甲基纖維素，離子交換和葡聚糖凝膠層析等方法純化角蛋白酶，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。將角蛋白粉、硫酸鹽緩沖液和培養(yǎng)濾液混合放至水浴搖床，各成分的配比因角蛋白酶種類的不同有所差異。反應(yīng)一定時(shí)間后添加乙酸使反應(yīng)終止。采用分光光度法，以僅缺少三氯乙酸的樣品作為對(duì)照，每增長(zhǎng)一單位吸收值代表一單位的酶活性。不同反應(yīng)條件會(huì)影響酶活性，比如由弧菌分離出的角蛋白酶適宜在37℃反應(yīng)，而產(chǎn)自金黃桿菌的蛋白酶在30℃、偏堿性條件下有最高的催化活性。此外，NaCl和十二烷基硫酸鈉(SDS)等化學(xué)試劑的添加也會(huì)影響酶活性。

2.3.3 酶對(duì)羽毛的降解

酶對(duì)羽毛的降解既要考慮促進(jìn)生產(chǎn)蛋白酶的產(chǎn)酶菌生長(zhǎng)條件，也要考慮使角蛋白酶具有高催化活性的反應(yīng)條件。Fakhfakh等將地衣芽孢桿菌RPK培養(yǎng)在含有7.5 g/l雞羽毛，2 g/l的酵母提取物，0.5 g/l NaCl，0.1 g/l MgSO4·7H2O，0.7 g/l KH2PO4和 1.4 g/l K2HPO4的培養(yǎng)基中，37℃下攪拌48 h可使絲氨酸蛋白酶的產(chǎn)量和活性都達(dá)到較高水平。Cao等從一種嗜食單胞菌分離出具有羽毛降解活性的角蛋白酶，在pH值7.8和40℃條件下，羽毛得到最大程度的降解，酶的活性可完全被一種絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制，而金屬離子又可提高酶活性。近幾年固定化蛋白酶的利用較廣泛，固定酶可最大限度減少酶的自溶，有利于產(chǎn)物蛋白質(zhì)或多肽的分離，酶可以被重復(fù)利用。Lin等將角蛋白酶固定在孔徑可調(diào)的玻璃微珠上，這種分離自地衣芽孢桿菌PWD-1的酶在酸性條件下顯示出更好的熱穩(wěn)定性和耐受性，7 d后仍有40%的活性。

角蛋白酶的穩(wěn)定性和活性受溫度、pH值和化學(xué)底物影響。甲醇、乙醇和異丙醇等有機(jī)溶劑可誘導(dǎo)酶的活性，酶則表現(xiàn)出更高的催化效應(yīng)，而EDTA抑制酶活性，加入5～10 mmol EDTA會(huì)導(dǎo)致30%的酶活性喪失。不同酶的反應(yīng)速率也有所不同，從金黃桿菌分離出的角蛋白酶具有更快的降解速率。

3 角蛋白的綜合應(yīng)用

3.1 動(dòng)物飼料

蛋白飼料的使用可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，獲得更好的飼喂效果，目前動(dòng)物蛋白飼料有豆粕、魚粉和肉粉等，這類飼料蛋白含量高，飼喂效果較好，但價(jià)格昂貴，部分需要進(jìn)口，動(dòng)物飼料資源的缺乏一定程度上制約著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。角蛋白被認(rèn)為是一種優(yōu)質(zhì)蛋白飼料，對(duì)比實(shí)驗(yàn)證明，角蛋白混合物和玉米大豆粉有相似的促生長(zhǎng)作用，其豐富的來源和低廉的成本有望解決飼料資源短缺的問題。

3.1.1 飼料制備

羽毛角蛋白飼料的制備經(jīng)歷了幾個(gè)階段，最早以家禽羽毛制成羽毛粉作為動(dòng)物飼料，但受角蛋白不溶性的影響，其消化率僅為9.6%，遠(yuǎn)低于大豆蛋白99.5%的消化率，受限的飼喂效果影響了飼料的大規(guī)模應(yīng)用。后來采用物理方法降解羽毛，利用高溫膨化法對(duì)羽毛進(jìn)行擠壓，產(chǎn)物基本達(dá)到飼用要求，但需要在高溫高壓、長(zhǎng)時(shí)間的特殊環(huán)境下操作，會(huì)對(duì)產(chǎn)物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成破壞。隨著羽毛降解研究的深入，角蛋白飼料的生產(chǎn)已從傳統(tǒng)的高壓水解、化學(xué)水解等過渡到生物技術(shù)處理羽毛制備飼料。

酶法制備是利用特異性角蛋白酶對(duì)羽毛進(jìn)行降解，產(chǎn)物含有可溶性角蛋白、多肽和多種游離氨基酸，經(jīng)分離純化后制成高蛋白動(dòng)物飼料，或與糠麩、糟渣等農(nóng)副產(chǎn)品配合制成復(fù)合蛋白飼料。最近發(fā)現(xiàn)，角蛋白酶能提高飼料轉(zhuǎn)化率，在每千克大豆粉和棉籽粉飼料中加入1 g角蛋白酶，可顯著提高氮存留率和淀粉消化率。顯微鏡觀察肉雞小腸證實(shí)角蛋白酶能提高絨毛高度與隱窩深度比值，表明小腸消化吸收功能增強(qiáng)，酶和角蛋白有望不經(jīng)分離用于動(dòng)物飼料的制備。

3.1.2 飼料營(yíng)養(yǎng)成分

飼料的營(yíng)養(yǎng)成分直接影響動(dòng)物對(duì)飼料的適口性，高效蛋白飼料應(yīng)包含蛋白質(zhì)、必需氨基酸、脂類和提供礦物質(zhì)元素的鹽類。蛋白質(zhì)的供給使動(dòng)物胴體脂肪減少，瘦肉率提高，賴氨酸可促進(jìn)肌內(nèi)脂肪和肌紅蛋白合成，色氨酸具有改善肉質(zhì)功效，鈣離子參與的肌肉收縮能提高肉的鮮嫩度。飼料蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值常以氨基酸消化率評(píng)定，測(cè)定指標(biāo)有糞表觀消化率、回腸表觀消化率（AID）和標(biāo)準(zhǔn)化回腸消化率（SID），飼料成分的搭配可參考美國(guó)NRC、英國(guó)ARC給出的動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需要和飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。

角蛋白飼料營(yíng)養(yǎng)搭配合理，膨化羽毛后粗蛋白含量在85%以上，使蛋白供應(yīng)不會(huì)低于臨界蛋白水平而使動(dòng)物采食量減少。羽毛降解產(chǎn)物含有鈣、磷等生長(zhǎng)必需礦物質(zhì)元素，可減少在飼料中人工添加鹽類帶來的環(huán)境污染。賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和色氨酸作為主要限制性氨基酸影響動(dòng)物生長(zhǎng)代謝，必需氨基酸的平衡搭配是保證動(dòng)物正常生長(zhǎng)的重要因素，當(dāng)配比失衡時(shí)動(dòng)物甚至?xí)x擇不含蛋白的飼料進(jìn)食。角蛋白飼料本身含有多種必需氨基酸，對(duì)比研究表明，羽毛酶解產(chǎn)物中賴氨酸和甲硫氨酸等氨基酸含量要顯著高于NaOH的堿法降解產(chǎn)物，經(jīng)簡(jiǎn)單的后加工流程制得回報(bào)率高的角蛋白飼料。

3.1.3 飼料的喂養(yǎng)

動(dòng)物的日糧供應(yīng)會(huì)影響生長(zhǎng)發(fā)育，應(yīng)根據(jù)其體重變化分為不同的飼養(yǎng)階段。Noreen等用羽毛粉、豆粕和30%的玉米麩質(zhì)飼喂重1.23 g的魚苗，以占魚苗濕重4%的飼料添加量進(jìn)行6周實(shí)驗(yàn)，每天早上8點(diǎn)和下午2點(diǎn)分兩次提供飼料。結(jié)果顯示羽毛粉組魚苗重量為（1.88±0.04）g，低于玉米麩質(zhì)組的（2.07±0.01）g，可能是羽毛粉僅含45%的粗蛋白影響了飼喂效果。飼料的喂食狀態(tài)會(huì)影響動(dòng)物的適口性，粉狀或微粒狀的蛋白飼料與片狀或塊狀飼料雖然消化率相似，但對(duì)動(dòng)物自然采食量有不同影響。對(duì)于動(dòng)物的飼養(yǎng)，可利用其屠宰、加工產(chǎn)生的大量下腳料和角蛋白飼料組成復(fù)合飼料，在節(jié)約成本的同時(shí)獲得良好的飼喂效果。

3.1.4 飼料安全問題

目前飼料制備常添加抗菌藥和生長(zhǎng)促進(jìn)劑以獲得更好的飼喂效果，但對(duì)動(dòng)物和人類健康帶來安全隱患。飼料加工、運(yùn)輸過程中容易引起飼料霉變，黃曲霉等霉菌的產(chǎn)生會(huì)使動(dòng)物中毒，很多飼料原料本身含有毒物質(zhì)，棉籽餅粉中含有1%左右的有毒棉酚，飼喂未經(jīng)脫毒的餅粉會(huì)引起動(dòng)物中毒。角蛋白飼料不含抗?fàn)I養(yǎng)因子，簡(jiǎn)化了原材料的預(yù)處理流程，飼料均衡的營(yíng)養(yǎng)搭配可減少添加劑的摻入量，在加工運(yùn)輸中不易導(dǎo)致飼料霉變，具有更高的安全性，但在羽毛加工飼料前一定對(duì)羽毛進(jìn)行高溫預(yù)處理，旨在殺滅因羽毛收集過程中控制不嚴(yán)格混入的病死動(dòng)物羽毛所攜帶的致病源。

3.2 醫(yī)藥行業(yè)

將羽毛角蛋白降解為可溶性蛋白質(zhì)后，可利用蛋白質(zhì)中氨基與其它高分子材料的基團(tuán)相連接，構(gòu)成角蛋白高分子聚合物。由于可溶性蛋白質(zhì)的存在，聚合物具有優(yōu)良的生物降解性能，可應(yīng)用于醫(yī)藥制品、人工支架或高吸收材料的醫(yī)用敷料制備。利用角蛋白制備的生物凝膠用于創(chuàng)傷相關(guān)的神經(jīng)缺損修復(fù)，作用機(jī)制是通過激活雪旺氏細(xì)胞介導(dǎo)穩(wěn)定高效的神經(jīng)再生反應(yīng)，擴(kuò)大了角蛋白在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用范圍。

3.3 優(yōu)良復(fù)合材料

角蛋白可作為纖維素角蛋白復(fù)合材料的組分，較一般纖維素材料有較小的吸附性，較高的吸濕性和較小的潤(rùn)濕角。角蛋白海綿適合作為良好支撐物用于細(xì)胞培養(yǎng)，和傳統(tǒng)基于聚苯乙烯的細(xì)胞培養(yǎng)底物相比，這種支撐物更能改善細(xì)胞生長(zhǎng)代謝水平。

3.4 食品行業(yè)

二硫鍵和氫鍵的交聯(lián)賦予角蛋白很強(qiáng)的成膜能力，可作為外包膜用于食品包裝。蛋白膜堅(jiān)固、柔韌、無異味，可減少廢棄包裝材料對(duì)環(huán)境的危害，但需要加入一些增塑劑，如甘油、山梨醇等以提高蛋白膜的熱學(xué)和力學(xué)等性能。

4 小結(jié)

角蛋白飼料的應(yīng)用對(duì)于動(dòng)物飼料供給具有重要意義，但角蛋白的難溶性會(huì)影響動(dòng)物飼喂效果，需要降解羽毛得到水溶性角蛋白或多肽。目前，液體角蛋白的研究不夠深入，不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)，制約工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸是有效的羽毛降解方法。物理法因其特殊的高溫高壓環(huán)境，會(huì)破壞肽鏈或氨基酸內(nèi)部結(jié)構(gòu)，降解產(chǎn)物的應(yīng)用范圍受到制約；化學(xué)法得到的降解產(chǎn)物穩(wěn)定性較差，需進(jìn)行化學(xué)修飾后才能被進(jìn)一步利用。相較其它方法，酶法水解羽毛具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物特異性高和環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，降解產(chǎn)物更適合高蛋白飼料的制備。相信隨著更多產(chǎn)酶菌的篩選會(huì)分離出適宜的角蛋白酶，降解獲得性能優(yōu)良的可溶性蛋白或多肽，更廣泛地應(yīng)用到飼料、復(fù)合材料、生物制品、醫(yī)藥等行業(yè)。

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