肺炎衣原體的發(fā)現(xiàn)、傳播和檢出

張 莉,黃偉忠,張國良

肺炎衣原體的致病性非常廣泛[1],作為人類疾病的病原體在過去 30多年來已經報道的致病性涉及廣泛,呼吸系統(tǒng)有咽喉炎、哮喘、支氣管炎和社區(qū)獲得性肺炎;心血管系統(tǒng)有心肌炎、心內膜炎、動脈硬化和冠心病;其他系統(tǒng)有虹膜炎、肝炎、腦膜炎、結節(jié)性紅斑和關節(jié)炎等。

空氣中密布肺炎衣原體,因此,急性感染率和慢性感染率非常高。癥狀有嚴重及輕微,甚至不被察覺,且大都與感冒相似而被忽視,癥狀的不典型使診斷非常困難。

1 肺炎衣原體的發(fā)現(xiàn)

1965年預防接種中,從臺灣 1個兒童眼部第一次分離出肺炎衣原體毒株,命名 TW-183。十多年后的 1983年在美國西雅圖患急性咽喉炎的大學生的咽喉拭子中又分離出另 1毒株,命名 AR-39。由于兩者從培養(yǎng)特征到包涵體結構頗相似于鸚鵡熱衣原體,故合并后 TWAR,屬鸚鵡熱衣原體種。

其后幾年,陸續(xù)在西雅圖、芬蘭、英國及世界各地的急性呼吸道感染患者咽拭子中分離出眾多毒株,依照 TWAR的超微結構、DNA與 RNA組成、同源性、血清學特征等,均與鸚鵡熱衣原體顯著地不同。Grayston等[2]于 1989年提出將TWAR命名為一個新種:肺炎衣原體。其后得到國際的驗證及承認。

肺炎衣原體是介于病毒與細菌之間的專屬細胞內寄生的病原體。在宿主細胞內生長、繁殖和形成包涵體。包涵體大小在1～5μm之間,其中有:原生體 (elementary Body,EB)主要呈梨形,也有呈球形,大小在 0.1～1.0μm之間;網狀體 (reticulate Body,RB)主要呈圓形,大小在 0.5μm左右;中間體(intermediate Body,IB),形態(tài)不一,大小介于上述兩者之間。只有原生體對人類才有侵襲力和毒力,構成傳染源。

2 肺炎衣原體的傳播途徑

肺炎衣原體感染是一個呼吸道傳播的傳染病。傳播途徑是通過肺炎衣原體患者的飛沫或噴嚏,被健康人呼吸入呼吸道。肺炎衣原體在后者呼吸道細胞里生長、繁殖及侵襲,從而造成感染狀態(tài)。

肺炎衣原體是一個嚴格細胞內寄生的革蘭氏陰性小球菌。它不能獨立生活,必須依賴宿主細胞的能量和營養(yǎng)才能自我生長、繁殖。肺炎衣原體有它獨特的生活周期:健康人通過飛沫吸入肺炎衣原體原生體→進入健康者的呼吸道,并被巨噬細胞吞飲,這個過程大約需 2～5h→原生體在巨噬細胞里若未被破壞而得以生存后,在細胞漿里發(fā)育成空泡樣結構,稱中間體,這個過程大概 10h→中間體吸取寄生細胞的能量,開始分裂、繁殖,生長出數量不等的新的小體,其形態(tài)似網狀,故名網狀體→在巨噬細胞的細胞漿里經過多次的反復分裂、繁殖和增大,同時存在原生體、中間體和網狀體 3種小體,并有胞膜包裹,呈現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則的多形性及多樣性。這時稱這種結構為肺炎衣原體包涵體 (inclusion bodies)。從肺炎衣原體原生體入侵人體到形成包涵體大概需 3～4d,這段期間為感染的潛伏期→隨后,包涵體內容物即原生體、中間體和網狀體繼續(xù)生長、分裂和增大,使包涵體的胞膜破裂。巨噬細胞的細胞膜也破裂,數以百萬計的成熟 EB釋放出寄生的細胞,再次侵入宿主的健康組織和細胞或通過咳嗽排出體外,感染健康人群,造成新的的感染。

人類肺炎衣原體感染呈世界性流行,不分地域、種族和年齡限制。一年四季均可能發(fā)生,不呈季節(jié)性特征。流行可呈散發(fā)性或爆發(fā)性傳播,尤其在空間相對封閉、人群聚集較多、空氣不太流通的公共場所。所謂社區(qū)獲得性肺炎 (Community Acquired Pneumonia,CAP)是指醫(yī)院外罹患感染導致的肺實質、肺泡壁、肺間質的炎癥,包括入院后具有平均潛伏期內發(fā)生的肺炎 (以區(qū)分院內感染性肺炎)[3]。社區(qū)獲得性肺炎是威脅人類健康的重要疾病,尤其是老年患者。

肺炎衣原體感染的社區(qū)獲得性肺炎一般癥狀較輕[4],通常以咽喉痛、聲音粗啞等,數天后出現(xiàn)咳嗽、發(fā)燒、肺部可有或無異常呼吸音或啰音,末梢血白細胞計數可有正常,X-線檢查可有或無陰影,也有報道嚴重者出現(xiàn)大片均質浸潤表現(xiàn)。輕重不一的干咳遷延數周、數月不愈。

從行業(yè)角度出發(fā)，紐約電影學院在影視實踐課程的安排上更貼近影視工業(yè)的需求。在他們的人才培養(yǎng)過程中，雖然有很多課程也是通過現(xiàn)場表演，但是這些更多是作為一種形式最終還是為影視表演服務的。如該學院開設的《Scene Study（片段學習）》課程，最終成果要呈現(xiàn)為許多經典戲劇作品片段的舞臺匯報。雖然是舞臺匯報的形式，但這門課程的重點是要讓學生了解如何去分析劇本、將劇本中的各個要素進行分解、分析和體驗等。因此，從總體的課程安排來說，紐約電影學院在整個教學過程中比較注重影視實踐化教學，強調通過職業(yè)化的方式來培養(yǎng)影視表演人才。

3 肺炎衣原體的實驗室檢出

臨床依據患者的癥狀和體征,很難鑒別細菌性、病毒性、肺炎支原體或肺炎衣原體的感染,以致在臨床用藥上存在困難,一般只能依賴實驗室通過人體體液標本進行病因檢測。

3.1 免疫熒光標記檢測法 人體感染肺炎衣原體后經短暫的潛伏期,開始出現(xiàn)輕重不一的臨床癥狀,像感冒一樣頭痛、鼻涕、咽痛、伴或不伴低燒。在未經治療用藥之前以拭子 (要求使用亞麻、滌綸頭的拭子)取黏膜表層細胞,然后涂片,再以熒光標記的抗肺炎衣原體單克隆抗體的熒光素染色,在熒光顯微鏡下觀察,可見到針尖大小、翠綠色的熒光顆粒,此為直接免疫熒光法 (direct immuno-fluorescence,DIF)。取材部位和標本除鼻咽部的粘膜表層細胞外,還有深部痰液、肺泡灌洗液、陰道分泌物、尿道黏液等。檢測的陽性率取決于人群的感染期、取材時機、取材技巧及鏡下判斷經驗等因素。

1996年國際肺炎衣原體專家組協(xié)商會議,就肺炎衣原體作為病原體的致病性概況、作用及實驗室診斷等各個方面達成共識。提出微量免疫熒光法是目前血清學診斷肺炎衣原體感染的最普通、特異、敏感的方法。

間接微量免疫熒光法 (Micro-Immunofluorescent Assay,MIF)由于經過放大 5～10倍,提高了檢出的敏感性。檢測原理是,用肺炎衣原體感染的細胞如 HEp-2為抗原,固定在玻璃片上,滴加待檢的血清 (抗體)標本,再加入熒光素 (一般異硫氰酸熒光黃,FITC)標記的抗人球蛋白,在熒光顯微鏡下觀察最高稀釋度的血清出現(xiàn)翠綠色熒光小點為陽性效價。該法操作簡易,設備普通,被國際會議推薦常規(guī)應用。國際推薦標準是:(1)急性期感染為 2次效價達 4倍或以上或單次IgM≥1∶16;或 IgG≥1∶512者;(2)既往感染為 IgM≤1∶16,或 IgG在 1∶16～1∶256之間者;(3)再次感染為 IgG在 1～2周效價迅速升高,IgM不出現(xiàn)或弱者。當 IgM陽性判斷時需排除類風濕因子的干擾。

3.2 多聚酶鏈反應檢測法 很多工作者應用 PCR法檢測肺炎衣原體研究[5]。不同研究者使用不同的保守區(qū)酶切點設計的引物不同,擴增產物的核苷酸序列也各異。Gaydos等報道用16SrRNA基因序列,設計出 21bp的引物 A和 B,擴增出466bp的片段產物。上述專家組也提出肺炎衣原體感染的理想診斷應是抗體滴度升高 4倍,伴有 PCR陽性。國內糜祖煌[6]報道運用套式 PCR采用 Campbell報道的二對引物 HL-1和HR-1內套引物得 378bp片段。李濤等[7]報道亦用套式 PCR根據 Campbell報道的特異性 Pst1酶限制性片段序列,通過計算機模擬,設計出二對引物 (內引物和外引物),并用丹麥 U-niversity of Aazhus贈送的 Cpn-DNA標準質粒為陽性對照。產物經序列測定查證測序圖與肺炎衣原體 TW-183株,T-138株和 AR-39株,及主要外膜蛋白 (MOMP)基因序列比較,同源性達 96%以上。套式 PCR較之普通 PCR有了二次的擴增,產物更多,在 Agarose凝膠電泳上更敏感從而使某些假陰性樣品可以出現(xiàn)陽性。

3.3 外周血單核細胞內肺炎衣原體抗原/包涵體檢測法 1995年 Campbell[8]應用稀釋 1:1000的 CF-2過氧化物酶染色法,生物素-抗生物素-過氧化物酶系統(tǒng)用屬特異性的單克隆抗體檢測肺炎衣原體脂多糖,證實在人冠狀動脈組織里證明有肺炎衣原體抗原存在。Charlotte等[9]證明肺炎衣原體可以在人巨噬細胞、內皮細胞和主動脈平滑肌細胞生長、繁殖和復制。國內王衛(wèi)群等[10]用直接免疫熒光法 (IF)檢測動脈病理組織及外周血單核細胞中也存在肺炎衣原體抗原,腹主動脈瘤組肺炎衣原體抗原陽性率 83.0%,正常血管組 12.5%,動脈瘤組織中肺炎衣原體的特異性抗原有較高的檢出率。

余竹元等[11]用吖啶橙代替 FITC標記單克隆抗體對肺炎衣原體 AR-39株感染的 HEp-2細胞株 72h后以單核細胞培養(yǎng)液進行吖啶橙染色,檢測肺炎衣原體包涵體認為該法具有簡捷價廉、反映包涵體核酸含量變化的優(yōu)點。蔡俊明[12]等用冰凍保存一年以上的外周抗凝血低滲法制備淋巴細胞懸液直接免疫熒光法檢測特異性肺炎衣原體包涵體。他們以肺炎衣原體TWL-029感染的 HEp-2細胞株,經 DIF染色后,在熒光顯微鏡下的細胞漿里,有被針對肺炎衣原體主要外膜蛋白(MOMP)的單克隆抗體結合,呈現(xiàn)熒光塊狀顯示者,以光學鏡及熒光顯微鏡判斷確立綠色熒光位置在單核細胞里面,稱為肺炎衣原體包涵體陽性;細胞核被 Evams Blue染色成紅色者成為陰性,冠心病患者陽性率 20/150(13.3%)。

Haranaga等對 237名健康獻血員的外周血5ml制備PBMC,用屬特異性熒光標記單克隆抗體染色,觀察到典型的蘋果綠色的肺炎衣原體包涵體,陽性率 8.8%。王衛(wèi)群等報道應用外周血淋巴細胞分離液離心法制備的 PBMC標本用改進的 DIF法,以特征性蘋果綠色染色熒光顆粒數減去空白數后,多于4個亮點者為包涵體陽性。檢測頸動脈硬化患者和正常人各 50例,陽性率分別是 62%和 30%。

3.4 細胞分離培養(yǎng)檢測法 肺炎衣原體只能在細胞內生長的病原體,只能在活的細胞里培養(yǎng)、繁殖和復制。常用的細胞培養(yǎng)株有 McCoy、Hela-229和 HEp-2等。染色后在鏡下觀察到細胞內包涵體或以熒光標記單克隆抗體法檢測。肺炎衣原體的組織培養(yǎng)和分離鑒定對肺炎衣原體感染的判斷具有決定性意義。尿道和宮頸拭子標本的培養(yǎng)具有特異性 100%及敏感性80%。然而培養(yǎng)法繁瑣、培養(yǎng)時間長、設備要求高、技術難度大,一般實驗室難以具備。另外,若培養(yǎng)陰性時,它仍有陽性的可能,不能獨立判斷為陰性,仍需要其他種方法佐證才能最終判斷為陰性。

3.5 膠體金檢測法 拭子標本在經 NaOH消化,分裂細胞和釋放抗原后,與抗肺炎衣原體單克隆抗體標記的膠體金顆粒結合,再滴加到吸附有抗肺炎衣原體屬特異性脂多糖單抗的硝酸纖維素薄膜上。若待檢拭子標本中有肺炎衣原體,則制成雙抗體夾心免疫復合物,觀察到一條紅色細線。此法可檢測宮頸、男性尿道、眼瞼結膜、男性尿液等的肺炎衣原體,優(yōu)點是特異、敏感、快速。

3.6 酶聯(lián)免疫固相檢測法 以酶標記的單克隆或多克隆抗體檢測肺炎衣原體,酶反應后生成有色的產物。Mazzoli[13]報道用重組衣原體 LPS抗原寶貝微極,當加入人待檢血液后,抗原-抗體結合,再加入過氧化物酶標記的抗人球蛋白,酶底物在 410nm的酶標儀下讀數,可檢出 IgM、IgG和 IgA抗體。Dako推出增強信號的酶聯(lián)免疫放大系統(tǒng),檢測拭子里屬特異肺炎衣原體。酶標記法簡便快捷,適合大批標本的同時檢測;缺點是某些細菌有交叉反應。酶聯(lián)免疫固相法檢測肺炎衣原體抗體以多少效價為標準很難確定。美國和加拿大疾控中心認為血清至少四周后有 4倍的抗體升高作為肺炎衣原體的感染較為合適[14]。

1 File TM,Bartlett JG,CassellGH,et al.The Importance of Chlamydia Pneumoniae as a pathogen:The 1996 consensus conference on Chlamydia Pneumoniae Infection[J].Infection Disease in Clinical Practice,1997,6:28-31.

2 Grayston JT,Kuo CC,Campbell LA,et al.Chlamydia Pneumoniae SP.Nova for Chlamydia SP.Strain TWAR[J].Int J Sys Bacteriol,1989,39(1):88-90.

3 Miyashita N,Fukawo H,Mouri K,et al.Seft-lim iting Pneumoniae Due to Chlamydia Pneumoniae[J].Internal Medicine,2005,44(8):870-874.

4 Miyashita N,Fukano H,Okimoton,et al.Clinical Presentation of Community-aquired Chlamydia Pneumoniae Pneumonia in adults[J].Chest,2002,121:1776-1781.

5 Boman J,Allrd A,Dersson K,et al.Rapid Diagnonsis of respiratory Chlamydia Pneumoniae infection by nested touchdown polymerase chain reaction compared with culture and antigen detection[J].Infect Dis,1997,175:1523-1526.

6 糜祖煌.肺炎衣原體的套式 (Nested)PCR檢測及其臨床意義[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,1997,5(2):14-16.

7 李濤,許香廣,蔡俊明,等.肺炎衣原體感染與急性冠脈綜合癥的相關性 [J].中國誤診學雜志,2005,5(1):4-7.

8 Campbell LA,Ewand RO,Alison L,et al.Detection of Chlamydia Pneumoniae TWAR in human Coronary Altherectomy fissues[J].The journal of infections disease,1995,172:585-588.

9 Charlotte AG,James TS,Narendra NS,et al.Replication of Chlamydia Pneumoniae in Vitro in human Macrophages,Endothelial Cells,and Aortic Artery Smooth Musc le cells[J].Infection and Immunity,1996,64(5):1614-1620.

10 王衛(wèi)群,張瑞華,龔輝,等.外周血單核細胞肺炎衣原體特異性抗原的檢測 [J].中國臨床醫(yī)學,2001,8(2):136-138.

11 余竹元,項俊慶,王衛(wèi)群,等.肺炎衣原體包涵體核酸組分衍化分析法的建立 [J].中國人獸共患病雜志,1999,15(5):9-11.

12 蔡俊明,許香廣,張國良,等.冠心病患者肺炎衣原體包涵體的檢測和意義 [J].海南醫(yī)學院學報,2009,15(11):1456-1458.

13 Mazzoli S,Tofain N,Fantini A,et al.Chlamydia Pneumoniae Antibody responsein patientswith acute Myocardial infarctiom and their Follow-up[J].Am Heart J,1998,153(1):15-20.

14 Dowell SF,Peeling RW,Boman J,et al.Standardijing Chlamydia Pneumoniae assay:Recommendation from the Centers for Disease Control and Prevention(USA)and the Laberatory Centre for Disease Control(Canada)[J].Clin Infect Dis,2001,33:492-503.