生物技術在昆蟲分類中的應用

黃海榮 程 菲 曾 春 王曉紅 唐艷龍 姜 靜

(1江西省信豐縣隘高林場,江西 信豐 331600;2江西省信豐縣林業(yè)局,江西 信豐 331600;3江西省瑞金市林業(yè)局,江西瑞金 342500;4中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所,北京 100091)

目前,已經(jīng)定名的昆蟲有 100多萬種,占已知動物的 2/3,但是全世界仍約有 90%的昆蟲是未知種[1]。隨著科學技術的進步以及各個學科的交叉滲透,已有 200多年歷史的昆蟲分類學也獲得了極大的發(fā)展,特別是現(xiàn)代生物技術的應用更加速了昆蟲分類學發(fā)展的步伐。長期以來,昆蟲分類主要是以外部形態(tài)特征為依據(jù)。因為外部形態(tài)特征較為直觀,且容易掌握,而根據(jù)昆蟲的形態(tài)特征作為分類依據(jù)在目等分類單元中可以很好的反映物種的分類地位。但是,在小的分類單元,如屬、族、種內(nèi)則不容易確定物種的分類地位,再到種群、生態(tài)型則更難確定分類地位。20世紀 70年代以來,先后出現(xiàn)了同工酶電泳、氣相色譜或氣質(zhì) -質(zhì)譜聯(lián)用技術、核酸序列分析、隨機擴增多態(tài)性 DNA(RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、分子雜交技術、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)及雙鏈構象多態(tài)性(DSCP)技術等多種現(xiàn)代生物技術,極大的促進了昆蟲分類學的發(fā)展。

1 研究及應用現(xiàn)狀

1.1 同工酶電泳技術

20世紀 70年代以來,生物化學研究手段逐漸進入分類學的各個領域,特別是同工酶的研究已成為鑒定物種和種間親緣關系等方面的重要方法。同工酶是由不同基因位點或等位基因編碼的多肽鏈的單體、純聚體或雜聚體,其理化或生物性質(zhì)不同而能催化相同化學反應的酶。同工酶能較好地反映不同昆蟲之間的遺傳差異,具有可靠的生理特性和物種遺傳性,對物種鑒別具有重要的參考價值。由于同工酶是基因的產(chǎn)物,能直接反映基因的異同,易于觀察研究,目前已作為一種生化遺傳標志廣泛地應用于發(fā)育生物學、群體遺傳學、系統(tǒng)分類學等各個領域[2]。通過物種同工酶的研究,可以推測物種在基因水平的不同,進而可以推測其血緣關系和進化地位[3]。

唐樺等通過酯酶同工酶電泳發(fā)現(xiàn)光肩星天牛Anoplophora glabripennis(Motschulsky,1853)和黃斑星天牛 A.nobilis(Ganglbauer,1889)在酯酶帶上差異甚微,認為這 2種天牛應歸屬于同 1個種[4]。張思宇等對 15種不同色斑型異色瓢蟲的同工酶進行比較研究,共獲得 25個同工酶位點,其中多態(tài)性位點 20個,多態(tài)位點百分率為 80%,從而明確了其遺傳變異的主線[5]。馬春燕等分析了蝽科 3亞科、9種蝽象的酯酶同工酶,發(fā)現(xiàn)同一亞種內(nèi)不同屬種間的 EST同工酶存在明顯差異,但小于不同亞種屬種間的差異;蝽亞科和益蝽亞科的親緣關系較近,而這2個亞科和盾蝽亞科的親緣關系較遠,這與形態(tài)學的劃分相一致[6]。

1.2 氣相色譜或氣質(zhì) -質(zhì)譜聯(lián)用技術

利用氣相色譜或氣 -質(zhì)譜聯(lián)用技術對昆蟲表皮中碳氫化合物進行分析,并以此為依據(jù)對昆蟲進行分類鑒定是近十幾年來昆蟲分類學發(fā)展的一個方面,主要用于近緣種及種群的研究。昆蟲表皮中的碳氫化合物是指存在于昆蟲上表皮中的碳數(shù)為 20～50、直鏈或支鏈、飽和或不飽和的長鏈烴類,是昆蟲表皮蠟層中主要成分[7]。據(jù)國內(nèi)外研究報道,昆蟲表皮碳氫化合物的組分和含量在種間存在差異,即使在親緣關系很近的種之間也有明顯差異[8]。

張紅兵等應用 GC-MS分析表明,不同種類白蟻表皮碳氫化合物組成和含量均有差異。結果表明,我國存在異白蟻屬,它與散白蟻屬主要區(qū)別在于其表皮缺乏以下數(shù)種碳氫化合物:正十七烷烴、正二十烷烴、正二十一烷烴、正二十二烷烴、正二十三烷烴、正二十四烷烴和正二十六烷烴等;卻含有一種特殊化合物異喹啉。表皮碳氫化合物分析的結果與形態(tài)分類的結果有一定差異,形態(tài)分類被鑒定為雙色散白蟻的 R.sp.1,被鑒定為小頭散白蟻的 R.sp.2,被鑒定為圓唇散白蟻的 R.sp.3,被鑒定為尖唇散白蟻的 H.sp.4,根據(jù)表皮碳氫化合物分析的結果,R.sp.1、R.sp.3和 H.sp.4可能是其他種,而R.sp.2則可能是圓唇散白蟻的亞種或其他種[9]。

1.3 核酸序列(線粒體 DNA和核糖體 DNA)分析技術

線粒體 DNA為雙鏈閉環(huán)分子。昆蟲的線粒體DNA大小為 15.4～16.3 kb,其中含有編碼 2個核糖體 RNA(12S rRNA,16S rRNA)、22個 t RNA、1個細胞色素 b、3個細胞色素氧化酶 (CO I、CO II、CO III)、6個 NADH降解酶(ND 1～6)和 2個 ATP酶(6和 8)的基因[10]。目前,通常用于昆蟲分類研究的基因有以下幾種:16S rRNA、細胞色素 b、ND2、CO I、CO II等 。

潘興麗等以線粒體細胞色素 b(Cyt b)基因作為分子標記,首次對緣蝽科 4亞科 14種昆蟲進行序列測定,獲得 Cyt b基因 412 bp的序列片段。以篩豆龜蝽為外群構建系統(tǒng)發(fā)育樹,表明在亞科級關系上,姬緣蝽亞科最原始,蛛緣蝽亞科次之,巨緣蝽亞科和緣蝽亞科親緣關系較近[11]。姚銀花等通過對我國大螟 Sesam ia inferens 9個地理種群的線粒體DNA CO II基因的測序,并分析了大螟不同地理種群之間的 CO II序列的遺傳分歧及相似性,同時建立其系統(tǒng)發(fā)育關系[12]。

核糖體 DNA是編碼核糖體 RNA的基因,是一類中度重復的 DNA序列,以串聯(lián)多拷貝形式存在于染色體 DNA中。每個重復單位由非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(NTS)、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)和 3種 RNA(18S、5.8S、28SRNA)基因編碼區(qū)組成[13]。由于 rDNA是生物界普遍存在的遺傳結構,具有多拷貝性、編碼區(qū)保守、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)中度保守等優(yōu)點,因而在個體及群體內(nèi)有較好的均一性,少量樣品能有效代表其來源群體的 rDNA的變異情況。因此,rDNA已成為生物系統(tǒng)進化研究中一個非常有用的分子標記[14]。

Flook和 Rowell測定了 29種多新翅類(Polyneoptera)昆蟲的 18S rDNA的全序列,并結合 Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中的 8種其它昆蟲的 18S rDNA全序列,重建了傳統(tǒng)的古翅亞部(Palaeoptera)和新翅亞部(Neop tera)昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育,其結果支持直翅目的單系性[15]。劉殿鋒等人測定了斑腿蝗科(Catantopidae)10亞科 20種蝗蟲和其它蝗科 3種蝗蟲的線粒體 16S rDNA部分序列,并從 GenBank中下載了蝗亞目(Locustodea)15個種的 16S rDNA相應序列片段,構建了系統(tǒng)發(fā)育樹,但分子系統(tǒng)學研究結果和基于形態(tài)特征的斑腿蝗科傳統(tǒng)分類結果有很大的不同[16]。

1.4 RAPD和 RFLP技術

RAPD技術是由美國杜邦公司的科學家 J.G.K.Williams和加利福尼亞生物研究所 J.Welsh兩個研究小組在 1990發(fā)展起來的以 PCR為基礎的一項 DNA分子水平上的大分子多態(tài)檢測技術[17]。其原理是用隨機序列的 9-10個核苷酸的引物對基因組的 DNA進行 PCR擴增,再進行電泳分離與溴化乙錠染色。RAPD技術具有簡便、快捷、靈敏、多態(tài)性檢出率高、所需 DNA量少等特點,因此被迅速用于個體和品系鑒定、基因的多態(tài)分析、基因定位、構建遺傳圖譜、標記輔助選擇和種間遺傳分析等領域的研究。目前 RAPD技術已成為昆蟲遺傳圖譜構建中的一種普遍方法,該技術一出現(xiàn),就被用于蚊蟲的分子系統(tǒng)學研究。

南宮自艷等采用 RAPD技術,分析了 5種松毛蟲 10個地理種群的種群內(nèi)、種群間的遺傳多樣性,檢測和描述在不同地理環(huán)境條件下的松毛蟲種群的遺傳結構和變異情況,為松毛蟲的綜合防治提供有效的依據(jù)[18]。趙慧婷等采用 RAPD技術對來自中國境內(nèi) 8個省市的 28群東方蜜蜂 Apis cerana進行了研究,探討了它們之間的親緣關系[19]。

RFLP技術(限制性片段長度多態(tài)性分析)是由Bostein在 1980年首先建立并發(fā)展起來的一種分子遺傳標記技術。它是指應用限制性內(nèi)切酶切割不同類群個體基因組 DNA或某一基因,產(chǎn)生不同長度的限制性片段,根據(jù)酶切圖譜,計算類群之間的遺傳距離,構建系統(tǒng)樹。賈正輝等應用 PCR-RFLP技術對來自四川省 8個地方的枯死松樹樣品中的傘滑刃屬線蟲群體進行了分子鑒定。該研究中選用的 4種限制性內(nèi)切酶(DraⅠ 、SalⅠ 、HhaⅠ 、AluⅠ )除 SalⅠ外均可對所鑒定的 6種傘滑刃屬線蟲產(chǎn)生特異性的酶切位點,從而均可有效地鑒別出松材線蟲、擬松材線蟲和其他 4種傘滑刃屬線蟲,其結果可為今后這幾種傘滑刃屬線蟲的分子鑒定提供一定的參照[20]。

1.5 分子雜交技術

核酸的分子雜交技術是現(xiàn)代分子生物學研究中常用的方法之一,它和克隆技術密不可分,并且在基因表達、調(diào)控以及在物種親緣關系的研究中具有重要作用。最基本的分子雜交技術包括原位雜交技術、Northern分子雜交技術和 Southern分子雜交技術。在昆蟲學研究主要應用核酸分子技術檢測起遺傳的多態(tài)性、DNA的同緣性和 mRNA的差異來鑒別昆蟲的近緣種以及地理種群。分子雜交的關鍵是制備特異性強和靈敏度高的探針。目前應用較多的是地高辛和生物素等非放射性標記探針。Lorite等利用原位雜交對葉甲科 Chrysomelidae昆蟲 Chrysolina americana的微衛(wèi)星進行了研究[21]。

1.6 SSCP和 DSCP技術

SSCP技術 (單鏈構象多態(tài)性分析)及 DSCP技術 (雙鏈構象多態(tài)性分析)的基本原理相似,都是依據(jù) DNA分子在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時,其遷移率除與 DNA的長短有關外,更主要的是取決于 DNA鏈所形成的構象。SSCP技術自1989年由 Masato Orita等人建立以來,就以其靈敏性廣受關注。李石柱等就使用 PCR-SSCP技術對我國多斑按蚊復合體 5個成員種進行了分子鑒別,分析其 28S-D3擴增產(chǎn)物,結果顯示電泳條帶具種特異性,可用于鑒別各蚊種[22]。DSCP技術在昆蟲分類上的應用不多,在國內(nèi)未見有相關報道。

2 問題與展望

隨著生物技術的迅猛發(fā)展,以及同工酶電泳、氣相色譜或氣質(zhì) -質(zhì)譜聯(lián)用技術、細胞遺傳學研究技術、核酸序列分析、RAPD、RFLP、分子雜交、SSCP及DSCP等分子生物學技術在昆蟲分類研究中的應用和有益探索,或是解決了傳統(tǒng)分類中所存在的學術疑難問題,或是驗證了傳統(tǒng)分類所得出的結論,已顯示出其應有的優(yōu)勢和廣闊的發(fā)展前景。

然而生物技術在昆蟲研究中的應用時間畢竟不長,還存在不少問題。首先是目的基因或 DNA片段的選擇,如何在龐大的昆蟲 DNA文庫中選擇最有利于昆蟲分類、最能反映其進化關系的基因或 DNA片段,仍存在較大難度。其次是用不同的目的基因或DNA片段對同一昆蟲進行研究,可能會得到不同的結果。再次是分析軟件或程序包的應用,目前有大量的分子生物學分析軟件,不同的軟件或程序包有許多不同的假設和參數(shù),研究者采用不同的分析軟件或采用同一軟件而設置不同的參數(shù),同樣的數(shù)據(jù)可能會得到不同的結果。如何解決好這些問題是今后昆蟲分類科學研究工作中的重要任務。

隨著生物技術的迅速發(fā)展,實驗技術的不斷發(fā)展和改進,它必然會推動昆蟲學在分子水平上的發(fā)展。昆蟲分類學是昆蟲學研究中的基礎領域,也是傳統(tǒng)領域,可以預見在不遠的將來,古老的昆蟲分類研究隨著不斷創(chuàng)新的理論和技術的發(fā)展,將有新的更大的成就。

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