不同功能化量子點與細胞的非特異性作用研究*

王 青,張鵬飛,羊小海,王柯敏,武春雷

(湖南大學 化學生物傳感與計量學國家重點實驗室,化學化工學院,生物納米與分子工程湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410082)

隨著納米技術的飛速發(fā)展,納米顆粒在生物醫(yī)學檢測、生物活性物質或細胞快速分離、藥物可控性定向傳遞和釋放等領域顯示出巨大的應用前景[1-2],因此納米顆粒與細胞的相互作用受到人們廣泛關注.納米顆粒與細胞的相互作用是一個復雜的過程,該過程除了與納米顆粒本身特性相關,包括納米顆粒形狀[3]、大小[4]、帶電荷量[5]、表面特性[6],以及發(fā)生聚集的能力[7]等;還和細胞所處的周期以及細胞類型密切相關.

半導體熒光量子點(Quantum Dots,QDs)具有獨特的光學性質,如:吸收光譜寬且連續(xù),熒光發(fā)射光譜窄而對稱,光學穩(wěn)定性強,抗光漂白性能好等[8-9],非常適合用于細胞生命過程的可視化研究.

本文使用激光共聚焦熒光顯微鏡研究了活細胞對不同功能化基團修飾的量子點的非特異性吸附行為,并考察了量子點濃度、培育時間、培養(yǎng)基中的血清及溫度等因素對其的影響,為進一步開展基于量子點的細胞成像研究與應用提供參考.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

硒粉(純度 99.5%)、氧化鎘(純度 99.998%)、氧化鋅(純度99%)、三辛基膦(純度90%)、三辛基氧化膦(純度90%)、油酸(純度90%)和硫粉(純度99%)均購自美國Sigma-Aldrich公司;十八胺(純度97%)和十八烯(純度90%)購自比利時Acros公司;1,2-二硬脂酰-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-羧基(聚乙二醇2000)(COOH-PEG-PE)、1,2-二硬脂酰-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-氨基(聚乙二醇2000)(NH2-PEG-PE)和1,2-二硬脂酰-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-甲基(聚乙二醇2000)(CH3-PEG-PE)購自美國Avanti lipid公司;其它試劑均為國產分析純,實驗用水均為Millipore超純水(18.2 M Ω·cm).非洲綠猴腎細胞系(COS-7)為本實驗室?guī)齑?復蘇后用常規(guī)方法接種于質量比為15%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基(加青霉素100 IU/mL,鏈霉素100 IU/mL)中,于 37 ℃,體積比為5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),實驗過程中COS-7細胞分別接種于玻璃底培養(yǎng)皿中.實驗中所用緩沖溶液均為10 mM PBS緩沖溶液(pH=7.4).

FV500-IX70激光共聚焦熒光顯微鏡(日本,Olympus公司);Malvern Zetasizer 3000HS分析儀(英國,Malvern公司);Nu-4750E細胞培養(yǎng)箱(美國,Nuair公司);UV-1601紫外-可見分光光度計(日本,Shimadzu公司);F-4500熒光光譜儀(日本,Hitachi公司);CS150GX超高速離心機(日本,Hitachi公司).

1.2 量子點表面不同功能化基團的修飾與表征

參照文獻[10]制備CdSe/ZnS量子點,并對量子點表面進行修飾.分別將 COOH-PEG-PE,NH2-PEG-PE,CH3-PEG-PE的氯仿溶液和CdSe/ZnS量子點混合于圓底燒瓶中,控制真空度為0.1 Pa,溫度在37℃,旋轉蒸發(fā)儀轉速為100 r/min,恒溫減壓旋轉蒸發(fā)成一層透明薄膜.然后在圓底燒瓶中加入少量的超純水溶解并將溶液移入超速離心管,使用超高速離心機,在10℃,500 000 g條件下離心2 h,取紅色沉淀重新分散在超純水中即可分別得到氨基表面(NH2-PEG-QDs),羧基表面(COOH-PEG-QDs),甲基表面(CH3-PEGQDs)的磷脂膠束修飾的量子點溶液.按文獻[11]的方法對修飾后的量子點進行定量,并分別用紫外-可見分光光度計、熒光光譜儀和Zetasizer分析儀對不同功能基團修飾的量子點進行表征.

1.3 不同功能化基團修飾的量子點在細胞表面的非特異性吸附

將細胞分別與含有不同濃度量子點(終濃度5～800 nM)的新鮮無血清培養(yǎng)基在37℃培育6 h后,用PBS緩沖液洗滌,加入1 mL無血清無酚紅培養(yǎng)基,用激光共聚焦顯微鏡成像,以研究量子點濃度的影響.

將細胞分別與含有終濃度100 nM量子點的新鮮無血清培養(yǎng)基在37℃培育不同時間(0.5～24 h)后,用PBS緩沖液洗滌,加入1 mL無血清無酚紅培養(yǎng)基,用激光共聚焦顯微鏡成像,以研究培育時間的影響.

將細胞分別與含有終濃度100 nM量子點的新鮮無血清培養(yǎng)基和有血清培養(yǎng)基在37℃孵育18 h后,用PBS緩沖液洗滌,加入1 mL無血清無酚紅培養(yǎng)基,用激光共聚焦顯微鏡成像,以研究培養(yǎng)基中的血清的影響.

將細胞分別與含有終濃度100 nM量子點的新鮮無血清培養(yǎng)基在不同溫度條件下(4℃,10℃,25℃,37℃)孵育18 h后,用 PBS緩沖液洗滌,加入1 mL無血清無酚紅培養(yǎng)基,進行激光共聚焦顯微鏡成像,以研究培養(yǎng)溫度的影響.

2 結果與討論

2.1 不同功能化基團修飾的量子點表征

不同功能化基團修飾的量子點的ξ電位分別為(46.4±0.8)mV(NH2-PEG-QDs),(-1.2±0.8)mV(CH3-PEG-QDs)和(-36.1±0.8)mV(COOH-PEG-QDs).這種電位差別是由于顆粒表面修飾的化學基團不同所致:NH2-PEG-QDs因其表面的—NH2在水溶液中質子化(—NH+3)而帶正電荷,從而表現(xiàn)出較強的正電勢;COOH-PEGQDs點表面的—COOH在水溶液中去質子化(—COO—)而帶負電荷,因此呈現(xiàn)出較強的負電勢;對于CH3-PEG-QDs而言,甲基很難因質子化或者去質子化而帶電荷,但由于該量子點表面修飾有磷脂分子,而磷脂分子帶有負電荷,使得CH3-PEGQDs帶少量負電荷.另外,這三種功能化基團修飾的量子點的熒光發(fā)射波長均為580 nm,和未修飾的量子點熒光光譜一致,說明表面修飾沒有對量子點的熒光特性造成明顯影響見圖1.

圖1 不同修飾量子點的吸收光譜與熒光光譜Fig.1 Absorbance and fluorescence spectra of QDs with different modification

2.2 不同功能化基團修飾的量子點與細胞的非特異性吸附

2.2.1 量子點濃度的影響

考察了不同濃度的NH2-PEG-QDs,COOH-PEG-QDs及CH3-PEG-QDs分別與COS-7細胞作用6 h的情況,結果如圖2所示.其中從左至右量子點濃度分別為5 nM 、20 nM 、50 nM、100 nM 、200 nM、400 nM和800 nM,從上至下分別為NH2-PEG-QDs,COOH-PEG-QDs及CH3-PEGQDs分別與COS-7細胞作用 6 h的情況.對于NH2-PEG-QDs而言,當濃度為50 nM時,細胞上出現(xiàn)明顯熒光信號,并且隨著量子點濃度的增加而增強,細胞上的熒光強度也逐漸增加;對于COOH-PEG-QDs而言,當濃度達到100 nM時,可觀察到細胞上出現(xiàn)熒光信號,其強度也隨著量子點濃度增加而增強;而對于CH3-PEG-QDs而言,當濃度高達400 nM 時細胞上才可觀察到熒光信號.

這3種量子點表面沒有細胞膜特異性的配體,因此圖2中細胞上的熒光信號是由量子點與細胞之間非特異性的靜電吸附所引起的.大多數(shù)細胞膜表面帶負電荷,容易吸附表面帶正電荷的量子點(如NH2-PEG-QDs);另外,細胞膜表面還鑲嵌了各種膜蛋白,有些膜蛋白在生理條件下帶正電荷,會吸附表面帶負電荷的量子點(如COOH-PEG-QDs);相對而言,表面幾乎不帶電荷的量子點(如CH3-PEG-QDs)與細胞的非特異性吸附就顯得小些.

2.2.2 共孵育時間的影響

考察了NH2-PEG-QDs,COOH-PEG-QDs及CH3-PEG-QDs分別與COS-7細胞在37℃孵育不同時間的情況,結果如圖3所示.其中從左至右孵育時間分別為0.5 h、1 h、3 h 、6 h、12 h 、18 h 和24 h,從上至下分別為NH2-PEG-QDs,COOHPEG-QDs及CH3-PEG-QDs與COS-7細胞在37℃孵育不同時間的情況.隨著孵育時間的增加,均可觀測到細胞上熒光信號強度的增強,說明細胞上非特異性吸附這三種量子點的量在增加.在相同的時間內,NH2-PEG-QDs在COS-7細胞上的吸附最多,其次是COOH-PEG-QDs,CH3-PEGQD的吸附最少.

圖2 量子點濃度的影響孵育溫度為37℃,時間為6h.標尺:50 mm.物鏡:20倍Fig.2 Effect of concentration of QDs on QD-cell interactions

圖3 共孵育時間的影響量子點濃度為 100 nM,孵育溫度為37℃.標尺:50 mm.物鏡:20倍Fig.3 Effect of incubation time on QD-cell interactions

2.2.3 血清的影響

考察了培養(yǎng)基中血清對不同功能化基團修飾的量子點與細胞作用的影響,結果如圖4所示.從圖中可以看出,血清的存在可以明顯降低量子點在細胞上的吸附,這可能是由于血清中的某些成分與量子點發(fā)生非特異性吸附,從而改變量子點表面的電荷與大小,進而使得這些量子點難以吸附在細胞上.

圖4 血清的影響量子點濃度為100 nM,孵育溫度為37℃,孵育時間為18 h;標尺:50 μ m;物鏡:20倍Fig.4 Effect of serum on QD-cell interactions

2.2.4 孵育溫度的影響

考察了NH2-PEG-QDs,COOH-PEG-QDs及CH3-PEG-QDs分別與COS-7細胞在不同溫度下的孵育情況,結果如圖5所示.從圖可知,孵育溫度對NH2-PEG-QDs與細胞作用的影響非常明顯:隨著孵育溫度升高,熒光強度明顯增加,說明細胞上量子點的數(shù)量明顯增加.孵育溫度對COOHPEG-QDs與細胞作用的影響相對較小,而對CH3-PEG-QD幾乎沒有影響.

一般而言,細胞與量子點的作用主要包括量子點在細胞膜表面的吸附和量子點的內化兩個階段.當細胞在4℃培育時,由于缺少能量,細胞的生命活動受到了抑制,此時量子點與細胞作用主要是在細胞膜表面的吸附.在37℃培育時,量子點的吸附和內化同時發(fā)生,所以在37℃培育溫度下,對NH2-PEG-QDs與COOH-PEG-QDs而言,與細胞結合的量子點的量要遠遠高于在4℃條件下的結合量.而CH3-PEG-QD,由于表面ξ電位為(-1.2 ±0.8)mV,既不易吸附在細胞表面,也不易通過內化進入細胞,因此孵育溫度對其與細胞作用影響不大.

圖5 孵育溫度的影響量子點濃度為100 nM,孵育時間為18 h;標尺:50 μ m;物鏡:20 倍Fig.5 Effect of incubation temperature on QD-cell interactions

綜上所述,量子點與細胞的作用是一個依賴于量子點的濃度、表面電荷、培育時間與溫度,并受培養(yǎng)基中血清影響的耗能過程.該研究工作為進一步開展基于量子點的細胞成像研究與應用提供參考.

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