豬分子育種研究進(jìn)展

劉 榜

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物分子生物學(xué)與育種實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

分子育種主要是一種利用DNA 水平上的分子標(biāo)記對(duì)生物群體進(jìn)行遺傳改良。動(dòng)物分子育種方法主要包括標(biāo)記輔助育種、轉(zhuǎn)基因育種和體細(xì)胞克隆育種。本文主要從標(biāo)記輔助育種和轉(zhuǎn)基因育種兩個(gè)方面綜述豬分子育種的研究進(jìn)展。

1 標(biāo)記輔助育種

標(biāo)記輔助育種是利用DNA 水平上的分子標(biāo)記進(jìn)行豬的遺傳改良，現(xiàn)階段DNA 標(biāo)記輔助育種技術(shù)僅僅是一種輔助手段，還必須與常規(guī)育種技術(shù)特別是數(shù)量遺傳學(xué)方法相結(jié)合，故稱(chēng)之為標(biāo)記“輔助”育種。標(biāo)記輔助育種中DNA標(biāo)記的鑒定是基礎(chǔ)，目前雖然有大量的豬經(jīng)濟(jì)性狀候選基因多態(tài)性以及關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，但真正已經(jīng)鑒定的QTN 卻甚少。QTN 鑒定需要利用大規(guī)模的資源群體和基因組信息，現(xiàn)對(duì)豬基因組研究進(jìn)展、可以利用的QTN 及標(biāo)記輔助選擇方法進(jìn)行介紹。

1.1 豬基因組計(jì)劃研究進(jìn)展

豬基因組研究已經(jīng)從單個(gè)基因的克隆和功能研究發(fā)展到對(duì)整個(gè)基因組的研究。中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所(Beijing Genomic Institute)與丹麥動(dòng)物科學(xué)研究所(Danish Institute of Animal Science)、皇家獸醫(yī)與農(nóng)業(yè)大學(xué)(the Roya l Veterinary and Agriculture University(KVL))、丹麥養(yǎng)豬業(yè)的代表共同于2000 年10 月20 日簽署豬基因組測(cè)序計(jì)劃協(xié)議。至2005 年，該計(jì)劃完成了380 萬(wàn)個(gè)鳥(niǎo)槍法測(cè)序反應(yīng)結(jié)果，覆蓋了0.66 個(gè)基因組（Wernersson,R 等，2005），并建立了97 個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)化的cDNA 文庫(kù)，提供了大約100 萬(wàn)條EST 序列（Gorodkin,J.等，2007）。在繼2004 年先后完成了雞和牛的基因組測(cè)序后，美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)展開(kāi)了豬基因組研究計(jì)劃，2006 年獲得了USDA 首批1000 萬(wàn)美元的基金支持，正式在Sanger 基因組測(cè)序中心開(kāi)始以杜洛克豬為材料的基因組測(cè)序工作。到2009 年10 月2 號(hào)，已完成了豬98%的基因組草圖，所有序列都已經(jīng)釋放，可以通過(guò)Preensemble(http://www.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index)獲得。

1.2 已經(jīng)應(yīng)用于標(biāo)記輔助育種的QTN

QTN 是指通過(guò)改變某個(gè)特定核苷酸，能夠使個(gè)體的表型從一種轉(zhuǎn)變到另外一種（Glazier,2002）?？梢哉f(shuō)QTN 是性狀產(chǎn)生變異的基礎(chǔ)，是QTL 對(duì)表型影響的根本原因。目前，在豬中已經(jīng)鑒定出3 個(gè)與肌肉發(fā)育和日增重相關(guān)的QTN 和1個(gè)可能的影響肌肉生長(zhǎng)的QTN，他們分別是蘭尼定1 型受體基因（ryanodine receptor 1,RYR1）、胰島素樣生長(zhǎng)因子2型基因（insulin-like growth factor 2,IGF2）、黑皮質(zhì)素受體4（melanocortin receptor 4,MC4R）基因和肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin,MSTN）基因。

RYR1 參與了豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，與骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)中主要鈣離子釋放通道。在該基因1843bp 位置發(fā)生的一個(gè)CT突變，導(dǎo)致編碼蛋白在這個(gè)位置從精氨酸到半胱氨酸的改變（Fujii J 等，1991）。在不同的豬品種中，這個(gè)堿基的改變與瘦肉率和體重呈顯著相關(guān)。2003 年，與豬肌肉發(fā)育相關(guān)的第二個(gè)QTN 在印記表達(dá)的IGF2 基因中發(fā)現(xiàn)（Van Laere A等，2003），在IGF2 的第三內(nèi)含子中的一個(gè)進(jìn)化保守的CpG島區(qū)域，3072 位置的GA 突變導(dǎo)致了該基因表達(dá)量升高三倍，并增加了豬的肌肉生長(zhǎng)速度和心臟體積與減少了脂肪的沉積。MC4R 是一個(gè)G 蛋白偶聯(lián)受體，參與了一個(gè)與采食量和能量平衡的重要通路。Kim KS,等（2000）在MC4R中發(fā)現(xiàn)893 位GA 錯(cuò)義突變導(dǎo)致了其編碼的天冬氨酸改變成天冬酰胺，這個(gè)變異被證實(shí)是影響背膘厚、日增重的QTN。第4 個(gè)可能的QTN 是MSTN 啟動(dòng)子中的447 位AG 突變，Stinckens A 等（2008）發(fā)現(xiàn)該突變導(dǎo)致了肌細(xì)胞增強(qiáng)子3（MEF3）的結(jié)合位點(diǎn)的丟失，并發(fā)現(xiàn)發(fā)生突變的四周齡仔豬比野生型的MSTN 基因的表達(dá)水平低，推測(cè)該位點(diǎn)可能是影響肌肉生長(zhǎng)的QTN。上述4 個(gè)QTN 對(duì)豬日增重與肌肉生長(zhǎng)性狀有較大影響，均可作為標(biāo)記在選種中應(yīng)用。但在應(yīng)用的過(guò)程中應(yīng)考慮他們之間的相互作用，有關(guān)4 個(gè)基因間的互作Stinckens,A 等（2009）在長(zhǎng)白豬和大白豬中發(fā)現(xiàn)了他們之間的關(guān)系。

1.3 標(biāo)記輔助選擇方法

標(biāo)記輔助選擇（Marker Assisted Selection,MAS）是通過(guò)尋找對(duì)動(dòng)物特定性狀有較大影響的數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quantitative Trait Loci,QTL）附近的分子標(biāo)記，并 通過(guò)判斷標(biāo)記的基因型對(duì)種畜進(jìn)行選擇的方法。利用MAS可以做出早期選種，縮短世代間隔，提高選擇的準(zhǔn)確性、提高選擇強(qiáng)度，降低育種成本，加快遺傳進(jìn)展，特別對(duì)于遺傳力低的性狀、晚期表現(xiàn)性狀，以及活體難于度量的性狀更具有價(jià)值。目前，依據(jù)選擇標(biāo)記與性狀控制位點(diǎn)的關(guān)系，MAS 可分為標(biāo)記距離較遠(yuǎn)的連鎖平衡（Linkage Equilibrium,LE）MAS（LE-MAS），標(biāo)記距離較近的連鎖不平衡（Linkage Disequilibrium,LD）MAS（LD-MAS），以及標(biāo)記本身即為causal 位點(diǎn)的基因輔助選擇（Gene Assisted Selection,GAS）。這三種方法都已經(jīng)在動(dòng)物育種上進(jìn)行了應(yīng)用。此外，最近還出現(xiàn)了一種全基因組選擇的方法，預(yù)計(jì)將是未來(lái)標(biāo)記輔助選擇發(fā)展的重要方向之一，但目前因?yàn)闄z測(cè)成本過(guò)高暫時(shí)還不能大面積推廣使用，同時(shí)全基因組選擇亦還有部分理論和方法問(wèn)題尚未完全解決。

1.3.1 連鎖平衡MAS

連鎖平衡MAS 使用的是連鎖平衡標(biāo)記（LE 標(biāo)記），LE標(biāo)記都是在一些對(duì)性狀有較大影響的QTL 區(qū)域附近，是一類(lèi)與QTL 連鎖的標(biāo)記。由于LE 標(biāo)記相對(duì)LD 標(biāo)記和直接標(biāo)記，它與形成QTL 中的致因突變位點(diǎn)相隔還較遠(yuǎn)，只是與QTL 有一定程度的連鎖，選擇效果不能保證，特別是不能保證所有家系中都存在這種連鎖關(guān)系。所以，在實(shí)施選種中，不能跨越家系去使用LE 標(biāo)記，這限制了連鎖平衡MAS 的使用范圍。

1.3.2 連鎖不平衡MAS

連鎖不平衡MAS 使用的是連鎖不平衡標(biāo)記（LD 標(biāo)記），這類(lèi)標(biāo)記主要是通過(guò)精細(xì)定位或者候選基因的方法得到的（Rothschild and Soller,1997）。由于LD 標(biāo)記與對(duì)性狀影響的功能突變位點(diǎn)緊密連鎖，所以選擇的有效性大大地提高，而且通常能在不同的家系中應(yīng)用連鎖不平衡MAS 進(jìn)行選種。對(duì)現(xiàn)階段而言，LD 標(biāo)記應(yīng)是分子育種使用的主要標(biāo)記類(lèi)型。

1.3.3 基因輔助選擇

基因輔助選擇使用的是直接標(biāo)記，這種標(biāo)記直接來(lái)自對(duì)性狀有較大影響的QTN。由于這種標(biāo)記直接來(lái)源于影響性狀的基因的功能突變位點(diǎn)，所以能夠用于不同情形，包括不同家系的輔助選擇。但是，目前已經(jīng)在豬中鑒定的QTN 數(shù)量甚少，實(shí)際能用于基因輔助選擇的標(biāo)記并不多。

1.3.4 全基因組選擇

由于多個(gè)物種的測(cè)序完成和SNP 芯片的出現(xiàn)，一種新的選擇方法——全基因組選擇在2001 年被提出（Meuwissen，2001）。全基因組選擇是指使用覆蓋全基因組上的標(biāo)記來(lái)進(jìn)行選擇，與之前的MAS 相比，不依賴于對(duì)性狀影響較大的標(biāo)記的數(shù)目，并能對(duì)多個(gè)性狀進(jìn)行同時(shí)選擇，提高了選擇的準(zhǔn)確性。通常，全基因組選擇的方法有兩步，首先是通過(guò)對(duì)資源群體進(jìn)行全基因組的SNP 芯片掃描和各個(gè)性狀表性值的測(cè)定統(tǒng)計(jì)，估計(jì)出基因組不同組分對(duì)目標(biāo)性狀的影響程度，并構(gòu)建出育種值的預(yù)測(cè)模型；然后根據(jù)育種群體中多SNP、單倍型、單倍型域、染色體區(qū)段等綜合構(gòu)成的全基因組基因型信息進(jìn)行估計(jì)，得到個(gè)體的基因組估計(jì)育種值（Genome EBV,GEBV），然后依據(jù)GEBV 進(jìn)行選種。由于全基因組選擇利用的信息量最大，選擇的準(zhǔn)確性將極大地提升，這將是今后家畜分子育種的主要發(fā)展方向。

2 轉(zhuǎn)基因育種

轉(zhuǎn)基因育種是指通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法，將外源的基因（包括種內(nèi)和種間）整合到豬的基因組中或者將豬自身的基因敲除或沉默，借此來(lái)定向改變豬的性狀，以轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行的育種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為育種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：不但可以打破物種界限導(dǎo)入其他物種的優(yōu)良基因，也可以通過(guò)對(duì)物種內(nèi)現(xiàn)有基因組的“精細(xì)手術(shù)”，獲得依靠自然選擇與人工選擇無(wú)法新基因組合。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要用作生物工程手段，作為分子育種技術(shù)尚處于探索階段。但隨著國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專(zhuān)項(xiàng)的實(shí)施，轉(zhuǎn)基因技術(shù)將會(huì)成為家畜分子育種的重要內(nèi)容。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成功運(yùn)用于豬，獲得了一些轉(zhuǎn)基因豬。1985 年，Hammer 等通過(guò)顯微注射的方法，將由小鼠MT-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人生長(zhǎng)激素基因（hGH）注射到豬、羊和兔卵細(xì)胞的原核中，該融合基因成功地整合到了豬和兔的基因組上并能正常表達(dá)；1991 年，Shamay 利用同樣的方法，將小鼠乳清酸性蛋白基因（mWAP）轉(zhuǎn)入到豬，mWAP 基因在豬的乳腺中成功表達(dá)；1992 年，Swanson 等成功獲得了能生產(chǎn)人血紅蛋白的轉(zhuǎn)基因豬，Muller 等將小鼠的MX1 基因轉(zhuǎn)入豬體內(nèi)，試圖生產(chǎn)抵抗流感病毒的轉(zhuǎn)基因豬；1995 年，Rosengard 等將人的補(bǔ)體抑制因子和衰退加速因子(hDAF)轉(zhuǎn)移至豬胚中，有27 頭轉(zhuǎn)基因豬的hDAF 在其內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌和鱗狀上皮細(xì)胞等細(xì)胞中有不同程度的表達(dá)；2001 年，加拿大Guelph 大學(xué)Golovan 等人通過(guò)顯微注射原核胚的方法，培育出轉(zhuǎn)植酸酶的轉(zhuǎn)基因環(huán)保型豬，使得糞便中磷的排放量減少了75%；2003 年，Ramsoondar 等將α(1,3)半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因敲除的豬，試圖解決器官移植時(shí)的免疫排斥反應(yīng)；2004 年，日本克隆出體內(nèi)含有水母基因的轉(zhuǎn)基因豬；2006 年，Lai 等獎(jiǎng)秀麗線蟲(chóng)的編碼ω-3 脂肪酸去飽和酶（FAT-1）基因克隆到豬中，顯著地提高了組織中不飽和脂肪酸的含量。

我國(guó)的轉(zhuǎn)基因豬也已取得了重要成果：1989 年，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)陳永福與湖北省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所合作，將豬生長(zhǎng)激素基因（GH）轉(zhuǎn)入湖北白豬中，顯著提高了生長(zhǎng)速度與飼料利用率；湖北省畜牧所與中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)所合作，將抗豬瘟病毒（HCV）基因?qū)胴i中，獲得了抗豬瘟的轉(zhuǎn)基因豬（鄭新民、魏慶信等，1998）；2000 年，鄭新民、魏慶信等用顯微注射的方法，生產(chǎn)出來(lái)能夠合成人血清蛋白（HAS）的轉(zhuǎn)基因豬；2006 年底，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華教授帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)研制出中國(guó)首只轉(zhuǎn)基因“熒光豬”；2008 年，中國(guó)農(nóng)科院北京畜牧獸醫(yī)研究所李奎教授等人，繼美國(guó)之后培育出了轉(zhuǎn)FAT-1 基因的保健豬。這些轉(zhuǎn)基因材料一旦經(jīng)過(guò)生物安全評(píng)價(jià)就可以作為育種素材進(jìn)行新品種的培育。目前，我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物新品種重大專(zhuān)項(xiàng)的啟動(dòng)將進(jìn)一步推動(dòng)轉(zhuǎn)基因豬的研究進(jìn)程。