羊水細(xì)胞原位培養(yǎng)法在β-珠蛋白生成障礙性貧血產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

盧秋維，李東明

(廣西壯族自治區(qū):1.人民醫(yī)院檢驗(yàn)科;2.婦幼保健院優(yōu)生遺傳科，南寧 5300211)

β-珠蛋白生成障礙性貧血是廣西地區(qū)危害最大的血紅蛋白病，目前尚缺少有效的治療方法，尤其是重型β-珠蛋白生成障礙性貧血患兒要靠輸血維持生命，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[1-3]。因此，對(duì)夫婦雙方為β-珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶的孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷，是防止此類(lèi)患兒出生的有效措施。但因母體血污染導(dǎo)致重型珠蛋白生成障礙性貧血胎兒的誤診或漏診時(shí)有發(fā)生[4-5]，為此本研究對(duì)羊水細(xì)胞進(jìn)行原位培養(yǎng)，采用培養(yǎng)后細(xì)胞進(jìn)行β-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)，避免了反復(fù)取材，提高了診斷的準(zhǔn)確性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 夫婦均為β-珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶的妊娠426例，其中曾生育重型β-珠蛋白生成障礙性貧血患兒者105例，有重型β-珠蛋白生成障礙性貧血胎兒引產(chǎn)史者17例，接受遺傳、產(chǎn)前咨詢者 304例。夫婦雙方合并α-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子37例。

1.2 標(biāo)本采集及細(xì)胞培養(yǎng) 在孕13～28周，B超引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺抽取羊水10～15 m L，置兩支15 m L無(wú)菌離心管中，血性羊水加入EDTA-K2抗凝。將1管羊水離心，棄上清液，留下1 m L左右;混勻后吸入裝有 3 m L AM-Ⅱ(美國(guó)GIBCO公司)培養(yǎng)基的原位培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d后，置倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn) 3～5個(gè)細(xì)胞克隆后，換掉培養(yǎng)液，當(dāng)出現(xiàn)大量貼壁細(xì)胞時(shí)，用生理鹽水反復(fù)清洗后，轉(zhuǎn)移到1.5 m L EP管內(nèi)備用。

1.3 珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè) 對(duì)培養(yǎng)后細(xì)胞采用快速DNA提取試劑盒(深圳益生堂公司)進(jìn)行DNA提取，采用單管多重PC R體系進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血基因擴(kuò)增，結(jié)合反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)17種β和3種α-珠蛋白基因突變類(lèi)型，限制性酶切結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)3種α-珠蛋白基因缺失類(lèi)型，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作及結(jié)果判斷。

2 結(jié) 果

426例羊水標(biāo)本，其中血性羊水2例，離心后肉眼可見(jiàn)血細(xì)胞6例，鏡下可見(jiàn)血細(xì)胞 13例，均培養(yǎng)成功，共檢出β-珠蛋白生成障礙性貧血302例，見(jiàn)表1。同時(shí)檢出 Hb Bart′s水腫胎9例，其中復(fù)合β-珠蛋白生成障礙性貧血雙重雜合子4例;Hb H病1例;α-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子17例，其中復(fù)合β-珠蛋白生成障礙性貧血純合子1例，雙重雜合子3例。21例母體血污染標(biāo)本，檢出β-珠蛋白生成障礙性貧血16例，其中β-珠蛋白生成障礙性貧血純合子1例;雙重雜合子5例，包括復(fù)合Hb Bart′s水腫胎1例;雜合子10例，包括復(fù)合α-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子2例。另檢出α-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子1例。終止妊娠107例，在本院引產(chǎn)或分娩的胎兒均經(jīng)驗(yàn)證，結(jié)果相符，隨訪238例，無(wú)畸形。

表1 培養(yǎng)后細(xì)胞β-珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷結(jié)果

3 討 論

β-珠蛋白生成障礙性貧血是β-珠蛋白基因缺失或突變導(dǎo)致血紅蛋白的珠蛋白肽鏈缺失或合成減少引起的溶血性遺傳病。若夫婦雙方為同型珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者，每次妊娠胎兒有25%為重型珠蛋白生成障礙性貧血兒。因此，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷有著重大意義[2，6]。目前，進(jìn)行胎兒基因診斷的取材方法主要有3種:經(jīng)腹腔或?qū)m頸絨毛活檢術(shù)、羊膜腔穿刺術(shù)和經(jīng)腹臍帶穿刺術(shù)。前者技術(shù)難度較大，1次取材成功率不高，且可增加胎兒畸形的發(fā)生率，易受蛻膜細(xì)胞污染造成誤診[7-8]。羊膜腔穿刺術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，是臨床應(yīng)用最廣泛的取材方法[9]。臍帶穿刺術(shù)操作難度較大，診斷時(shí)間也較晚，不易發(fā)現(xiàn)少量母血污染[10]。本組426例孕婦行羊膜腔穿刺術(shù)取羊水，進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血產(chǎn)前基因診斷，穿刺成功率為100%，無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生。

羊膜腔穿刺過(guò)程中難以避免母體血的污染，而不能檢測(cè)或再次取樣[11];當(dāng)標(biāo)本僅有極少量母體血污染，尤其是肉眼或離心后仍不可見(jiàn)時(shí)，易導(dǎo)致誤診[12]?；谔貉蛩?xì)胞貼壁生長(zhǎng)，而血細(xì)胞不貼壁生長(zhǎng)的特點(diǎn)，本研究應(yīng)用細(xì)胞原位培養(yǎng)法對(duì)羊水細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用培養(yǎng)后細(xì)胞進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血產(chǎn)前基因診斷。426例標(biāo)本均培養(yǎng)成功，共檢出β-珠蛋白生成障礙性貧血302例(70.89%)，其中純合子31例，雙重雜合子70例，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道相近[7，13]，也與東南亞地區(qū)為珠蛋白生成障礙性貧血高發(fā)區(qū)相一致。同時(shí)檢出α-珠蛋白生成障礙性貧血27例，其中重型α-珠蛋白生成障礙性貧血10例，包括復(fù)合重型β-珠蛋白生成障礙性貧血8例，與陳萍等[5]報(bào)道類(lèi)似。值得注意的是夫婦雙方為α復(fù)合β-珠蛋白生成障礙性貧血的孕婦中，因重型珠蛋白生成障礙性貧血引產(chǎn)或生育史而行產(chǎn)前診斷者有17例，此次診斷為重型珠蛋白生成障礙性貧血者有5例，其中1例已有3次重型珠蛋白生成障礙性貧血孕、育史。為避免該類(lèi)患兒的出生而再次終止妊娠，建議這類(lèi)夫婦進(jìn)行植入前產(chǎn)前診斷[14-15]，這對(duì)降低出生缺陷有重要意義。

值得注意的是，本研究 426例標(biāo)本中，離心前、后肉眼可見(jiàn)母體血細(xì)胞污染標(biāo)本8例，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)13例，在顯微鏡下仍可見(jiàn)一定數(shù)量的血細(xì)胞;當(dāng)羊水細(xì)胞貼壁后，保留換出的培養(yǎng)液。對(duì)檢測(cè)結(jié)果為β-珠蛋白生成障礙性貧血純合子和雜合子且與孕婦基因型不同的5例，再用換出的培養(yǎng)液提取DNA進(jìn)行檢測(cè)，僅有1例仍為β-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子?？紤]可能該標(biāo)本中的血細(xì)胞較少，以及提取過(guò)程中的丟失，導(dǎo)致該標(biāo)本中的母親基因型未被擴(kuò)增出來(lái)。表明當(dāng)有母體血污染時(shí)，尤其是肉眼不可見(jiàn)或離心后仍不可見(jiàn)的少量母體血污染的標(biāo)本，一旦被擴(kuò)增出來(lái)，可導(dǎo)致雜合子誤診為β-珠蛋白生成障礙性貧血雙重雜合子或漏診β-珠蛋白生成障礙性貧血純合子[9]。同樣，若夫婦雙方為東南亞缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者，當(dāng)有母體血污染時(shí)，Hb Bart′s水腫胎可誤診為東南亞缺失型[12]。因細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)難度較大，故對(duì)不具備細(xì)胞培養(yǎng)條件的基層醫(yī)院，應(yīng)對(duì)羊水細(xì)胞離心后在顯微鏡下進(jìn)行分析，減少母體血污染導(dǎo)致的誤診。

綜上所述，為了減少珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生，應(yīng)加強(qiáng)孕齡人群珠蛋白生成障礙性貧血產(chǎn)前篩查和基因確診[16-17]。對(duì)夫婦為同型基因攜帶者，在孕中期行羊膜腔穿刺術(shù)獲取羊水細(xì)胞，對(duì)羊水細(xì)胞進(jìn)行原位培養(yǎng)，所需標(biāo)本量較少，培養(yǎng)成功率高。采用培養(yǎng)后細(xì)胞進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷，可避免母體血污染導(dǎo)致的誤診，提高產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性;同時(shí)避免多次取材，減少流產(chǎn)的發(fā)生。

[1]Arthorn R，Issarang N ，KittiT ，et al.Economic burden of beta-thalassemia/Hb E and beta-thalassemia major in Thai children[J].BMC Research Notes，2010，30(3):29.

[2]Cao A ，Galanello R.Beta-thalassemia[J].Genet Med，2010，12(2):61.

[3]蔣利星.β-珠蛋白生成障礙性貧血反復(fù)輸血產(chǎn)生抗-E抗體 1 例[J].重慶醫(yī)學(xué)，2009，38(16):2132.

[4]李敏清，龐麗紅，石凌，等.經(jīng)宮頸絨毛取材用于珠蛋白生成障礙性貧血產(chǎn)前診斷883例分析[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2008，24(3):160.

[5]陳萍，龍桂芳，李樹(shù)全，等.771例α-珠蛋白生成障礙性貧血產(chǎn)前基因診斷[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，21(5):3.

[6]Li CG，Li CF ，Li Q ，et al.Thalassemia incidence and treatment in China with specialreference to Shenzhen City and Guangdong province[J].Hemogloin ，2009，33(5):296.

[7]Suhaib A.Prenatal diagnosis ofβ-thalassemia:12 years′experience ata single laboratory in Pakistan[J].Prenatal Diagnosis，2007，27(13):1224.

[8]Wolstenhoime J，Emslie JB，Connors S.Association of clinical cytogeneticists chorion villus sampling database 1987-2000[J].Prenat Diagn ，2006，26(5):420.

[9]Hossein N，Alireza G ，F(xiàn)arhad S，et al Fourteen-Year experience of prenataldiagnosis of thalassemiain Iran[J].Community Genet，2006 ，9(1)93.

[10]Liao C，Mo QH ，Li J，et al.Carrier screening for alphaand beta-thalassemia in pregnancy:The results of an 11-year prospective progrAMIn Guangzhou Maternal and Neonatalhospital[J].Prenat Diagn，2005，25(2):163.

[11]陳劍虹，林靜吟.羊膜腔穿刺術(shù)在產(chǎn)前診斷珠蛋白生成障礙性貧血中的應(yīng)用[J].國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2009，15(13):44.

[12]黃瑩，李東明.改良羊水原位培養(yǎng)技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].廣西醫(yī)學(xué)，2008，30(12):1852.

[13]李堅(jiān)，李冬至，廖燦，等.應(yīng)用反向點(diǎn)雜交法產(chǎn)前診斷β-珠蛋白生成障礙性貧血375例[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2007，15(7):11.

[14]Gibbons CA ，Allanson J，Blaine SM ，et al.Genetics:Preimplantation genetic diagnosis[J].Can Fam Physician，2010，56(3):247.

[15]Xu YW，Zeng YH ，Deng J，et al.Preimplantation genetic diagnosis for alpha-thalassaemia in China[J].J Assist Reprod Genet，2009，26(7):399.

[16]李軍，殷和.珠蛋白生成障礙性貧血的診斷技術(shù)及進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué) ，2009 ，38(7):864.

[17]呂福通，謝丹尼，陳一君，等.廣西區(qū)計(jì)劃生育服務(wù)網(wǎng)絡(luò)開(kāi)展珠蛋白生成障礙性貧血干預(yù)經(jīng)驗(yàn)[J].中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2009，19(4):241.