冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析

宋世威 李 珍 劉厚誠 孫光聞 陳日遠

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642）

冬瓜（Benincasa hispidaCogn.）為葫蘆科一年生草本植物，起源于中國南部和印度，我國主要分布在廣東、廣西、湖南、福建、江蘇、浙江、四川、湖北、安徽、河南、河北等省。節(jié)瓜（Benincasa hispidavar.chieh-quaHow）又名毛瓜、毛節(jié)瓜，是我國的特產(chǎn)蔬菜，主要分布在廣東、廣西、海南等地，在北方部分地區(qū)作為特菜栽培。節(jié)瓜是冬瓜的一個變種，兩者的親緣關(guān)系較近。前人從生物學(xué)性狀研究了冬瓜和節(jié)瓜的種質(zhì)資源（李文嘉 等，1996；謝大森 等，2009），但由于兩者的遺傳背景較狹窄，同名異物或同物異名現(xiàn)象非常普遍，僅利用生物學(xué)性狀進行區(qū)分和鑒定有較大難度。

RAPD分子標(biāo)記技術(shù)由于產(chǎn)物的多態(tài)性較強，廣泛用于葫蘆科作物，如黃瓜（Horejsi & Staub，1999；李錫香 等，2004）、南瓜（Gwanama et al.，2000；李俊麗 等，2005）、西瓜（Zhang &Rhodes，1993；郭軍 等，2002）、絲瓜（夏軍輝和向長萍，2008）、瓠瓜（高山 等，2007）及西葫蘆（陳鳳真和何啟偉，2010）等的遺傳多樣性研究，而關(guān)于冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)遺傳多樣性的研究較少（陳清華 等，2003）。本試驗利用RAPD技術(shù)分析41份冬瓜和節(jié)瓜栽培品種的遺傳多樣性，探討其親緣關(guān)系，為冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)資源評價和良種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2008年3～6月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜試驗基地進行。供試冬瓜和節(jié)瓜材料共41份，其中冬瓜18份，節(jié)瓜23份，均為商品種，供試材料名稱、來源及農(nóng)藝性狀見表1。供試種子用55～65 ℃溫水浸泡8 h后，置于30 ℃培養(yǎng)箱中催芽，待芽長0.5 cm時播于育苗盤中，植株長至4～6片真葉時取樣。

表1 供試材料名稱、來源及農(nóng)藝性狀

續(xù)表

1.2 DNA提取和RAPD分析

采用改良的CTAB法提取冬瓜和節(jié)瓜總DNA（Aljanabi & Martinez，1997），用紫外分光光度計在260 nm和280 nm處測定OD值，以檢測DNA的質(zhì)量和濃度，稀釋到5 ng·μL-1作為PCR擴增的模板。

經(jīng)正交優(yōu)化確定冬瓜和節(jié)瓜RAPD的最佳體系:25 μL反應(yīng)體系中含1×buffer，模板DNA 20 ng、Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.24 mmol·L-1、引物 0.3 μmol·L-1和Taq酶 1 U。最適宜的退火溫度是36.9 ℃。PCR擴增程序:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，36.9 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共40個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物在含0.5 μg·mL-1EB的1.8 %瓊脂糖凝膠中電泳2 h，用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)進行拍照分析。

1.3 聚類分析和主坐標(biāo)分析

將電泳圖譜清晰且可重復(fù)的DNA條帶記為1，同一位置上的弱帶且不重復(fù)或未出現(xiàn)條帶的記為0，形成1和0數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSYSpc（2.10）數(shù)據(jù)分析軟件進行聚類分析和主坐標(biāo)分析。用SimQual程序求相似性系數(shù)矩陣，用SAHN程序中的UPGMA方法進行聚類分析；用DCENTER程序進行系數(shù)矩陣轉(zhuǎn)換，并用EIGEN程序求特征值和特征向量進行主坐標(biāo)分析，用Tree plot模塊生成聚類圖，構(gòu)建分子進化樹，用3Dplot生成主坐標(biāo)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬瓜和節(jié)瓜DNA的RAPD多態(tài)性分析

從455條隨機引物中篩選出能夠產(chǎn)生穩(wěn)定、清晰多態(tài)性擴增譜帶的23條引物，23條引物對供試的41個冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)共產(chǎn)生143條擴增譜帶（引物序列及擴增結(jié)果見表2），其中多態(tài)性譜帶81條，多態(tài)性檢測率為56.6 %，平均每條引物產(chǎn)生6.2條譜帶。圖1、2分別為引物AX09和M16對41份種質(zhì)基因組DNA擴增的RAPD帶型。

不同引物擴增的譜帶數(shù)不同，其中擴增譜帶數(shù)最多的引物是 E03，擴增出 11條，其中多態(tài)性譜帶7條；擴增譜帶數(shù)最少的引物是AT08，僅擴增出2條。引物F09擴增譜帶的多態(tài)性比例最高，達到88.9 %，AX05和AY16的最低，僅為20.0 %（表2）。

表2 篩選出的引物序列及擴增結(jié)果

圖1 引物AX 09對41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)基因組DNA擴增的RAPD帶型

圖2 引物M16對41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)基因組 DNA擴增的RAPD帶型

2.2 聚類分析

利用143條RAPD擴增譜帶，用UPGMA法建立了41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)間的遺傳關(guān)系聚類分析圖（圖3）。聚類分析結(jié)果表明，41份種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.60～0.99之間。25號材料粵農(nóng)豐節(jié)瓜和30號材料粵農(nóng)6號節(jié)瓜的相似系數(shù)達0.99，表明兩者的親緣關(guān)系非常近，田間農(nóng)藝性狀完全一致，說明這兩個品種是同物異名；3號和5號兩份材料商品名均為特大粉皮冬瓜，但兩者的相似系數(shù)較小，為0.72，田間農(nóng)藝性狀也有較大差別，說明這兩個品種是同名異物。在遺傳相似系數(shù)0.71處可將供試的41份種質(zhì)劃分為6大類群9個亞類。

第Ⅰ類只有1份材料——特大粉皮冬瓜（3號），來源河北，早熟，大果類型，果實長筒形，果皮白綠色，密被毛刺和白色蠟粉。

第Ⅱ類也只有1份材料——廣利粉皮冬瓜（19號），來源廣東，中晚熟，大果類型，果實扁圓柱形，果形指數(shù)小于1，果皮白綠色被厚粉。

第Ⅲ類包括2份節(jié)瓜材料——長身黃毛節(jié)（16號）和5號黑毛節(jié)（17號），來源廣東，早熟，果實長圓柱形，果形指數(shù)大，果皮表面星點多。

第Ⅳ類包括 5份材料，可分為兩個亞類。① 揚子江粉皮大冬瓜（2號）、粉皮冬瓜（4號）和特大粉皮冬瓜（5號），分別來源于江西、北京和河北，早熟和中晚熟，大果類型，果皮白綠色，蠟粉重。② 薊農(nóng)一串鈴冬瓜（6號）和一串鈴冬瓜（7號），分別來源于天津和北京，早熟，小果類型，果皮青綠色，果形指數(shù)較小。

第Ⅴ類包括8份材料，可分為兩個亞類。① 臺灣特大黑皮冬瓜（1號）、廣東黑皮冬瓜（888）（13號）、碧玉出口節(jié)瓜（14號）、夏冠1號節(jié)瓜（15號）、廣優(yōu)1號節(jié)瓜（18號）和粵農(nóng)6號節(jié)瓜（30號）。兩份冬瓜分別來源于北京和廣東，早熟，大果類型，果皮墨綠色；4份節(jié)瓜均來源于廣東，果皮翠綠或深綠色。② 黑先鋒雜交大冬瓜（21號）和廣東黑皮冬瓜（22號），來源于廣東，早熟，大果類型，果實長圓柱形，果皮墨綠色。

第Ⅵ類包括24份材料，可分為兩個亞類。① 一串鈴4號冬瓜（8號）和精選一串鈴冬瓜（35號），均來源于北京，小果類型，果實高樁形，果皮青綠色。② 其余22份材料，包括5份冬瓜和17份節(jié)瓜。

圖3 41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)的RAPD標(biāo)記聚類圖

2.3 主坐標(biāo)分析

對RAPD標(biāo)記所獲得相似系數(shù)矩陣進行主坐標(biāo)分析，第一、第二和第三個主坐標(biāo)方差貢獻率分別為32.06 %、9.17 %和7.52 %，累計方差貢獻率48.75 %。41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)在第一主坐標(biāo)方向上被分為3類，在第二主坐標(biāo)方向上被分為2類，將第一和第二主坐標(biāo)作用綜合起來考慮可將41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)分為6大類群（圖4），這與聚類分析結(jié)果相近。

第Ⅰ類，一串鈴4號冬瓜（8號）和精選一串鈴冬瓜（35號）；第Ⅱ類，特大粉皮大冬瓜（3號）；第Ⅲ類，揚子江粉皮冬瓜（2號）、粉皮冬瓜（4號）、特大粉皮冬瓜（5號）、薊農(nóng)一串鈴冬瓜（6號）和一串鈴冬瓜（7號）；第Ⅳ類，臺灣特大黑皮冬瓜（1號）、廣東黑皮冬瓜（888）（13號）、黑先鋒雜交大冬瓜（21號）、廣東黑皮冬瓜（22號）、碧玉出口節(jié)瓜（14號）、夏冠1號節(jié)瓜（15號）、粵農(nóng)節(jié)瓜（20號）、長身黃毛節(jié)（16號）和 5號黑毛節(jié)（17號）；第Ⅴ類，廣優(yōu) 1號節(jié)瓜（18號）和廣利粉皮冬瓜（19號）；第Ⅵ類包括22份其余種質(zhì)。

圖4 41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)二維主坐標(biāo)圖

在第一、第二主坐標(biāo)分組的基礎(chǔ)上，結(jié)合第三主坐標(biāo)，41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)可分為 6大類群10個亞類（圖5）。第Ⅰ類分為2個亞類:① 一串鈴4號冬瓜（8號）；② 精選一串鈴冬瓜（35號）。第Ⅱ、第Ⅲ和第Ⅴ類在第三坐標(biāo)方向上沒有再細分，說明第一、第二主坐標(biāo)的信息足以將其區(qū)分開。第Ⅳ類分為2個亞類:① 長身黃毛節(jié)（16號）、5號黑毛節(jié)（17號）、粵農(nóng)節(jié)瓜（20號）、碧玉出口節(jié)瓜（14號）和廣東黑皮冬瓜（22號）；② 臺灣特大黑皮冬瓜（15號）、廣東黑皮冬瓜（888）（13號）、黑先鋒雜交大冬瓜（21號）和夏冠1號節(jié)瓜（15號）。第Ⅵ類分為3個亞類:① 粵農(nóng)208節(jié)瓜（37號）、七星節(jié)瓜（38號）、新會七江黑毛節(jié)瓜（39號）、特選種黑毛節(jié)瓜（41號）和江門利隆8號雜優(yōu)連環(huán)節(jié)瓜（40號）；② 旺優(yōu)七星節(jié)瓜（31號）、為農(nóng)高產(chǎn)節(jié)瓜（32號）、為農(nóng)節(jié)瓜（33號）和粵冠節(jié)瓜（34號）；③ 其余13份材料。

圖5 41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)的三維主坐標(biāo)圖

通過比較圖 3、4、5可知，對 41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)進行的系統(tǒng)聚類分析和主坐標(biāo)分析的結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論與討論

從本試驗結(jié)果來看，采用RAPD技術(shù)對冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)資源進行多態(tài)性分析，構(gòu)建了41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)的聚類分析圖和主坐標(biāo)分析圖，表明RAPD技術(shù)能有效地檢測冬瓜和節(jié)瓜材料間的遺傳變異，對其遺傳多樣性分析是可行的。

本試驗中采用聚類分析和主坐標(biāo)分析所獲得的結(jié)果基本一致。特大粉皮冬瓜（3號）單獨為一類，揚子江粉皮冬瓜、粉皮冬瓜、特大粉皮冬瓜（5號）、薊農(nóng)一串鈴冬瓜和一串鈴冬瓜為一類，這與聚類分析結(jié)果一致；豐青1號是冬瓜和節(jié)瓜兼用品種，在主坐標(biāo)分析中表現(xiàn)出與湖南的冬瓜種質(zhì)和部分節(jié)瓜品種較近的親緣關(guān)系；一串鈴4號冬瓜和精選一串鈴冬瓜在主坐標(biāo)分析中也被分到2個亞類。冬瓜和節(jié)瓜的分子標(biāo)記與種質(zhì)的果實大小、性狀和果皮顏色密切相關(guān)。

系統(tǒng)聚類分析能提供豐富的數(shù)量信息，量化地體現(xiàn)冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)之間的關(guān)系。主坐標(biāo)分析能從不同的方向和層面更直觀地提供更多的關(guān)于冬瓜和節(jié)瓜各種質(zhì)或群體的關(guān)系。因此，將聚類分析和主坐標(biāo)分析結(jié)合起來使用，可以互相印證和補充。在遺傳距離計算方法一致的情況下，采用主坐標(biāo)分析方法，對闡明冬瓜和節(jié)瓜間的親緣關(guān)系能提供更全面的信息。

RAPD分析結(jié)果顯示，冬瓜和節(jié)瓜最終沒有聚成兩大類，而是互有交叉地分散到6大類群中。這表明冬瓜和節(jié)瓜的親緣關(guān)系很近，從分子水平上進一步證明其屬于同一個種的不同變種。冬瓜各品種的相似系數(shù)多集中在0.60～0.80之間，而節(jié)瓜各品種的相似系數(shù)多集中在0.80～0.99之間，表明冬瓜的遺傳多樣性大于節(jié)瓜。這與兩個物種材料的來源密切相關(guān)，冬瓜分布范圍廣，供試的18份材料來源于7個?。欢?jié)瓜主要分布在華南地區(qū)，供試的23份材料全部來自廣東，遺傳背景狹窄。

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