• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    嗜酸乳桿菌的亞油酸異構(gòu)酶基因克隆及其pMG36e表達(dá)載體的構(gòu)建

    2010-08-09 02:38:40郎建華趙國芬李志剛包秋華
    飼料工業(yè) 2010年20期
    關(guān)鍵詞:異構(gòu)酶酸乳亞油酸

    郎建華 趙國芬 李志剛 鄭 婷 包秋華

    共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是亞油酸(linoleic acid,LA)衍生的共軛雙烯酸的多種位置與幾何異構(gòu)體的總稱。其中cis-9、trans-11和trans-10、cis-11兩種異構(gòu)體被證實具有很強(qiáng)的生理活性,具有抗動脈粥樣硬化、降低膽固醇、抗氧化、減肥、促進(jìn)生長、緩和免疫反應(yīng)副作用等優(yōu)點。

    20世紀(jì)80年代起,人們開始逐漸了解到,一些微生物細(xì)胞中的亞油酸異構(gòu)酶 (linolenic acid isomerase,LAI)可催化亞油酸轉(zhuǎn)化為共軛亞油酸的反應(yīng),并且反應(yīng)產(chǎn)物均為活性共軛亞油酸異構(gòu)體。亞油酸異構(gòu)酶最早發(fā)現(xiàn)于溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)中,之后,又發(fā)現(xiàn)痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)、棒桿菌(Cornebacterium ssp)等能產(chǎn)生亞油酸異構(gòu)酶。目前,有些菌種的亞油酸異構(gòu)酶已被分離純化。然而,這些菌種有些是厭氧的,不利于進(jìn)行大規(guī)模的產(chǎn)酶培養(yǎng);有些兼性厭氧菌生長較為緩慢,且生長會受到共軛亞油酸產(chǎn)物的抑制,并且傳統(tǒng)的CLA工業(yè)生產(chǎn)大多采用化學(xué)方法,存在產(chǎn)物難以分離、產(chǎn)物中含有環(huán)化副反應(yīng)、產(chǎn)品安全性低等問題,尚無法實際應(yīng)用。于是,構(gòu)建基因工程菌來表達(dá)亞油酸異構(gòu)酶,就成為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)共軛亞油酸的一條重要途徑。

    一些研究者開始將注意力轉(zhuǎn)移到一些厭氧條件相對不是很嚴(yán)格的菌種,并陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些具有共軛亞油酸轉(zhuǎn)化能力的兼性厭氧微生物,尤其是乳酸菌的研究和應(yīng)用價值逐漸顯現(xiàn)出來,目前,人們已發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬的多個種,如嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)、德氏乳酸桿菌保加利亞亞種(L delbrueckii subsp bulgaricus)、德氏乳酸桿菌亞種(L delbrueckii subsp Lactic)、羅伊氏乳桿菌(L reuteri)、干酪乳桿菌(L casei)、植物乳桿菌(L plantarum),以及和乳桿菌密切相關(guān)的乳球菌屬(Lactococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和丙酸桿菌屬(Propionibacterium)的多個種都具有亞油酸異構(gòu)酶活性。曹健、相麗新(2007)等已對嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的亞油酸異構(gòu)酶基因克隆及表達(dá)進(jìn)行了研究。

    本實驗將用嗜酸乳桿菌基因組為模板對LAI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,之后克隆入pMD-19T質(zhì)粒,再亞克隆到pMG36e質(zhì)粒中,構(gòu)建乳酸菌表達(dá)載體pMG36e-LAI,并轉(zhuǎn)化到DH5 α中,為利用工程菌工業(yè)化生產(chǎn)高產(chǎn)量、高活性亞油酸異構(gòu)酶制劑來生產(chǎn)CLA奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 質(zhì)粒、菌株

    嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)為本實驗室從益生菌酸奶發(fā)酵劑中分離出的菌株。E.coli JM109,為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)分子生物實驗室保存,用于質(zhì)粒pMG36e及其衍生質(zhì)粒的保存。E.coli JM109(pMG36e)為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品樓生物實驗室贈送。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    LB培養(yǎng)基按照分子克隆實驗指南進(jìn)行配制。

    1.1.3 酶及生化試劑

    所用限制性內(nèi)切酶SalⅠ、SphⅠ、異丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、X-Gal為大連寶生物公司產(chǎn)品。T4DNA連接酶、EX Taq DNA聚合酶、紅霉素均為TaKaRa公司產(chǎn)品。

    膠回收試劑盒為北京中科瑞泰公司產(chǎn)品,質(zhì)粒抽提試劑盒為Tian Gen公司產(chǎn)品。DNA連接試劑盒、pMD19-T試劑盒、DNA Marker均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品。

    1.1.4 主要試劑及溶液

    Tris-HCl緩沖液(pH值8.0)、TE緩沖液(pH值8.0)、溶菌酶(20mg/ml)、SDS(10%、50 μl)、蛋白酶 K、NaCl(5 M100 μl)、CTAB/NaCl(10%/0.7 M)、酚/氯/異戊醇(25: 24: 1)、氯仿/異戊醇(24: 1)、預(yù)冷異丙醇 、預(yù)冷乙醇(70%)、氯化鈣 。

    1.1.5 引物

    根據(jù)從國際基因庫(Gen Bank)中下載的多條LAI基因序列,并結(jié)合國內(nèi)董理等人的報道,利用Primer 5.0軟件,針對pMG36e質(zhì)粒的多克隆位點,設(shè)計了一對PCR擴(kuò)增引物:

    上游引物P1:

    5'—AAAGTCGACATGTATTATTCCAAT-3',(下 劃 線為SalⅠ酶切位點);

    下游引物P2:

    5'—AAAGCATGCTTAGACTAAATTTGCTTC-3',(下劃線為SphⅠ酶切位點)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 嗜酸乳桿菌總DNA的提取

    用CATB法提取。

    1.2.2 嗜酸乳桿菌LAI基因的PCR擴(kuò)增

    PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min,循環(huán)條件為:94℃變性30 s,47℃退火 45 s,72℃延伸2 min;循環(huán)30輪后,72℃保溫6 min并終止反應(yīng)。

    1.2.3 LAI基因PCR產(chǎn)物的克隆及鑒定

    用膠回收試劑盒純化LAI基因PCR產(chǎn)物后和pMD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化用氯化鈣法制備的感受態(tài)E.coli DH5 α,對陽性克隆用菌落PCR篩選及酶切鑒定。

    1.2.4 LAI基因測序和氨基酸序列推測

    篩選出含陽性克隆質(zhì)粒pMD19-T-LAI的陽性菌,送北京三博遠(yuǎn)志有限公司進(jìn)行序列分析并預(yù)測其氨基酸序列。

    1.2.5 LAI基因新型表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

    將LAI基因從pMD-19T-LAI克隆質(zhì)粒上用SalⅠ、SphⅠ限制性內(nèi)切酶切下,重新對應(yīng)連接到用相同內(nèi)切酶雙酶切后的大腸桿菌/乳酸菌表達(dá)載體pMG36e上,并將重組質(zhì)粒pMG36e-LAI轉(zhuǎn)入E.coli DH5 α。

    1.2.6 新型表達(dá)載體pMG36e-LAI的鑒定

    挑選出轉(zhuǎn)化平板上陽性菌落,并通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行陽性克隆的初步篩選,然后提取陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切分析。

    2 實驗結(jié)果與分析

    2.1 LAI基因的PCR擴(kuò)增

    用針對LAI基因設(shè)計的特異性引物以嗜酸乳桿菌基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果如圖1所示,2號泳道得到一條長約1.8 kb的特異性目標(biāo)帶,符合LAI基因的預(yù)期長度(1 776 bp)。

    圖1 嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因的PCR擴(kuò)增

    2.2 LAI基因的克隆及酶切鑒定

    圖2 陽性克隆菌液PCR檢測結(jié)果

    圖3 Sal I、Sph I雙酶切電泳檢測結(jié)果

    將大量PCR產(chǎn)物電泳、凝膠回收并純化后,直接與pMD-19T (2 692 bp)載體連接,然后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α,通過藍(lán)白斑篩選,挑取白色陽性克隆菌。陽性克隆菌落PCR結(jié)果見圖2。圖2中1、3、4號泳道均得到一條長約1.8 kb的特異性條帶,與預(yù)期的相同;提取其質(zhì)粒SphⅠ、SalⅠ雙酶切后,電泳檢測結(jié)果見圖3。圖3中2、3號均為陽性克隆質(zhì)粒(pMD-19TLAI)經(jīng)過雙酶切后,得到約1.8 kb和2.7 kb左右的片段,與我們插入的片段(1 776 bp)和質(zhì)粒pMD-19T大小一致,1號為pMD-19T-LAI質(zhì)粒,大小為4.4 kb,與預(yù)期的相符。證明陽性克隆質(zhì)粒pMD-19T-LAI構(gòu)建成功。

    2.3 亞油酸異構(gòu)酶基因測序及其氨基酸序列預(yù)測

    將陽性克隆菌DH5 α(pMD-19T-LAI)提交北京三博遠(yuǎn)志公司進(jìn)行克隆片段序列測定。

    LAI基因序列測定及分析表明,ORF全長1 776 bp,編碼591個氨基酸,編碼蛋白的相對分子質(zhì)量約67.6 kDa。

    將該測定序列與Gen Bank中登錄號為CP000033的嗜酸乳桿菌NCFM菌株的亞油酸異構(gòu)酶基因序列進(jìn)行比對,結(jié)果表明,該菌株亞油酸異構(gòu)酶基因的核苷酸序列與NCFM中的核苷酸序列長度相同,都是1 776 bp,編碼591個氨基酸,兩段序列中在1 338位置有1個堿基不同,同源性高達(dá)99%,但所編碼的氨基酸序列并沒發(fā)生變化。

    該基因測定序列與Gen Bank中登錄號為DQ239438的嗜酸乳桿菌AS1.1854菌株的亞油酸異構(gòu)酶基因序列進(jìn)行比對,結(jié)果表明,該菌株亞油酸異構(gòu)酶基因的核苷酸序列與AS1.1854中的核苷酸序列長度相同,都是1 776 bp,編碼591個氨基酸,兩段序列中有4個堿基不同,同源性高達(dá)99%,導(dǎo)致所編碼的氨基酸序列發(fā)生了變化。差別為該菌株編碼的氨基酸序列第157為E(谷氨酸),第286為F(苯丙氨酸),第506為V(纈氨酸);而AS1.1854菌株編碼的氨基酸序列對應(yīng)的為G(甘氨酸)、C(半胱氨酸)、A(丙氨酸)。其中G和E,以及C和F兩對氨基酸的極性不同,而A和V極性相同。

    對該嗜酸乳桿菌和AS1.1854所編碼氨基酸序列用Bioediter7.0進(jìn)行疏水性分析,結(jié)果見圖4。由于兩蛋白質(zhì)間只存在3個氨基酸的差別,因此,其疏水性譜非常相似,在兩序列的N端均有一疏水區(qū),可能存在信號肽。

    圖4 嗜酸乳桿菌株(a)和AS1.1854(b)亞油酸異構(gòu)酶基因氨基酸疏水輪廓平均數(shù)圖譜(Bioediter7.0)

    2.4 LAI基因新型表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

    圖5 陽性克隆菌落PCR電泳結(jié)果

    圖6 雙酶切質(zhì)粒pMG36e-LAI電泳檢測結(jié)果

    將Sph I和Sal I限制性內(nèi)切酶雙切后得到的LAI基因和pMG36e電泳、回收、純化、連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)的E.coli DH5α,挑白色菌落進(jìn)行PCR,結(jié)果如圖5,1、2、3號泳道均得到1.8 kb的片段,與目的片段大小相同;提取陽性克隆質(zhì)粒pMG36e-LAI進(jìn)行雙酶切結(jié)果如圖6,圖6中2號泳道出現(xiàn)了1.8 kb和3.4 kb左右的酶切片段,分別與目的片段 (1 776 bp)和pMG36e大小相同。圖5和圖6表明重組表達(dá)載體pMG36e-LAI構(gòu)建并轉(zhuǎn)化成功。

    3 討論

    通過設(shè)計特異性引物擴(kuò)增并克隆的LAI基因與現(xiàn)有報道的LAI序列高度相似,同源性為99%,可能是地域差異或不同亞種引起的,但預(yù)測的氨基酸順序和疏水性分析表明,該氨基酸序列與報道的氨基酸序列一致??梢灶A(yù)測這個堿基的改變不會引起LAI基因功能的改變。

    曹健等(2007)也對亞油酸異構(gòu)酶基因進(jìn)行了克隆與表達(dá),不同的是他們利用的是嗜酸乳桿菌AS1.1854菌株,表達(dá)載體是pET30a,轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21株中表達(dá),在低溫下誘導(dǎo)表達(dá)出重組蛋白,首次表達(dá)出了可溶性的亞油酸異構(gòu)酶。

    相麗新等(2007)利用植物乳桿菌 AS1·555,也克隆了亞油酸異構(gòu)酶,并將其克隆到pQE30質(zhì)粒載體上,進(jìn)行測序,結(jié)果表明與已報道的痤瘡丙酸桿菌共軛亞油酸異構(gòu)酶分子量(55 ku)相差較大,但與羅伊氏乳桿菌(70 ku)和短雙歧桿菌(70.5 ku)相近,其氨基酸序列與羅伊氏乳桿菌共軛亞油酸異構(gòu)酶只有32%的同源性,與痤瘡丙酸桿菌則沒有顯著同源性,說明了不同來源的共軛亞油酸異構(gòu)酶可能也存在物種多樣性或多形性。

    4 結(jié)語

    目前已成功構(gòu)建大腸桿菌pMG36e-LAI新型表達(dá)載體,如果能成功在大腸桿菌中高效表達(dá),可嘗試轉(zhuǎn)入乳酸菌工程菌MG1363,并獲得大量表達(dá),將為利用乳酸菌作為工程菌工業(yè)化生產(chǎn)獲得大量、高活性亞油酸異構(gòu)酶制劑,以及為研制多功能微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ),也為進(jìn)一步構(gòu)建食品級表達(dá)載體獲得可食用益生菌劑提供理論依據(jù)。

    15篇,刊略,需者可函索)

    猜你喜歡
    異構(gòu)酶酸乳亞油酸
    印度合成新型化合物可殺死癌細(xì)胞
    祝您健康(2019年7期)2019-07-12 03:11:52
    NH3和NaCl對共軛亞油酸囊泡化的影響
    紅花查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆及表達(dá)分析
    酪蛋白磷酸肽-鈣絡(luò)合物對酸乳貯藏特性的影響
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:23
    冷凍丙酮法提取山核桃油中的亞油酸和亞麻酸
    食品界(2016年4期)2016-02-27 07:37:06
    建立NHEJ修復(fù)定量體系并檢測拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑依托泊苷對NHEJ的影響
    超聲場中亞油酸共軛反應(yīng)的動力學(xué)
    嗜酸乳桿菌NX2-6凍干發(fā)酵劑的研究
    嗜酸乳桿菌細(xì)菌素Lactobacillin XH2分離純化研究
    嗜酸乳桿菌同化吸附降膽固醇作用機(jī)理研究
    一级黄片播放器| 春色校园在线视频观看| 高清日韩中文字幕在线| 久久精品人妻少妇| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲,欧美,日韩| 国产午夜精品论理片| 国产亚洲精品av在线| 全区人妻精品视频| 久久国产乱子免费精品| 我要看日韩黄色一级片| 成人av在线播放网站| 日本三级黄在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 日韩精品青青久久久久久| 男女下面进入的视频免费午夜| 我要看日韩黄色一级片| 少妇熟女欧美另类| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 熟女电影av网| 丰满的人妻完整版| 精品免费久久久久久久清纯| 国产日本99.免费观看| 国产伦精品一区二区三区四那| av.在线天堂| 久久精品国产清高在天天线| 天天躁日日操中文字幕| 日本在线视频免费播放| 看十八女毛片水多多多| 日韩中字成人| 岛国在线免费视频观看| 国产一级毛片在线| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久99蜜桃精品久久| 国产视频首页在线观看| 热99re8久久精品国产| 久久这里有精品视频免费| 两个人的视频大全免费| 亚洲国产欧美在线一区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 一本精品99久久精品77| 欧美区成人在线视频| 久久精品国产清高在天天线| 性色avwww在线观看| 高清在线视频一区二区三区 | 插逼视频在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 六月丁香七月| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 精华霜和精华液先用哪个| 国产黄色小视频在线观看| 久久精品久久久久久久性| 国产精品电影一区二区三区| 国内精品美女久久久久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 中国美女看黄片| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲色图av天堂| 一区福利在线观看| 欧美成人a在线观看| 国产久久久一区二区三区| 内射极品少妇av片p| 少妇人妻一区二区三区视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 中出人妻视频一区二区| 国产精品国产高清国产av| 国产不卡一卡二| 卡戴珊不雅视频在线播放| 99热这里只有精品一区| 国产精品.久久久| 久久这里只有精品中国| 午夜老司机福利剧场| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品av视频在线免费观看| 天天躁日日操中文字幕| 国产在视频线在精品| 看十八女毛片水多多多| av在线观看视频网站免费| 中文欧美无线码| 日韩高清综合在线| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 久久久久网色| 久久久a久久爽久久v久久| 国产美女午夜福利| 色视频www国产| 国产在线男女| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 最好的美女福利视频网| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲国产欧美人成| 国产高清激情床上av| 国产亚洲91精品色在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 色综合站精品国产| 一个人免费在线观看电影| 岛国在线免费视频观看| 午夜精品在线福利| 99热这里只有精品一区| 可以在线观看毛片的网站| 成年版毛片免费区| 亚洲精品日韩av片在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲va在线va天堂va国产| 一级黄片播放器| 99热这里只有精品一区| 国产精品不卡视频一区二区| 伦理电影大哥的女人| 91精品国产九色| 国产综合懂色| 白带黄色成豆腐渣| 欧美日本亚洲视频在线播放| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产老妇伦熟女老妇高清| 99精品在免费线老司机午夜| 又粗又爽又猛毛片免费看| 偷拍熟女少妇极品色| 人妻久久中文字幕网| 亚洲成人av在线免费| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 亚洲av不卡在线观看| 波野结衣二区三区在线| 爱豆传媒免费全集在线观看| 午夜激情福利司机影院| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 最后的刺客免费高清国语| 久久久精品大字幕| 2022亚洲国产成人精品| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| av在线蜜桃| or卡值多少钱| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久精品久久久久久久性| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 2022亚洲国产成人精品| 国产精品,欧美在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久久精品94久久精品| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产淫片久久久久久久久| 成年av动漫网址| 免费观看精品视频网站| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 欧美日本视频| 插逼视频在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产精品三级大全| 超碰av人人做人人爽久久| 欧美精品一区二区大全| 婷婷色综合大香蕉| 国产成人精品婷婷| 成人午夜高清在线视频| 青春草国产在线视频 | 99热精品在线国产| 国产老妇女一区| 亚洲自拍偷在线| 丰满人妻一区二区三区视频av| 麻豆国产97在线/欧美| 日日摸夜夜添夜夜爱| 在线免费观看不下载黄p国产| 韩国av在线不卡| 国产高清三级在线| 日本成人三级电影网站| 久久精品影院6| 最近的中文字幕免费完整| 少妇的逼水好多| 亚洲一区二区三区色噜噜| 日本与韩国留学比较| 波多野结衣高清作品| 美女内射精品一级片tv| 又爽又黄无遮挡网站| 久久久久久久久中文| 精品熟女少妇av免费看| 久久99精品国语久久久| 亚洲国产欧美在线一区| 老司机影院成人| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩欧美在线乱码| 免费观看在线日韩| 国产成年人精品一区二区| 国产精品一二三区在线看| 黄色日韩在线| 精品久久国产蜜桃| 成年av动漫网址| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美zozozo另类| 成人综合一区亚洲| 91av网一区二区| 午夜精品在线福利| 亚洲最大成人中文| 国产av不卡久久| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲欧美精品自产自拍| 嫩草影院新地址| 在线播放国产精品三级| 神马国产精品三级电影在线观看| 好男人视频免费观看在线| 国产伦精品一区二区三区四那| eeuss影院久久| 好男人在线观看高清免费视频| 91狼人影院| www.色视频.com| 99热6这里只有精品| 亚洲av二区三区四区| 国产男人的电影天堂91| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久热精品热| 国产黄色小视频在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲四区av| 丝袜喷水一区| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 波多野结衣高清作品| 色播亚洲综合网| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲成人av在线免费| 国产精品人妻久久久影院| 麻豆成人午夜福利视频| 波多野结衣巨乳人妻| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美一区二区亚洲| 91精品国产九色| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 国产精品乱码一区二三区的特点| 午夜福利高清视频| 国产精品女同一区二区软件| 99热这里只有是精品50| 亚洲成人中文字幕在线播放| 能在线免费观看的黄片| 国产老妇女一区| 免费看美女性在线毛片视频| 国产日韩欧美在线精品| 国产一区二区在线观看日韩| 最近2019中文字幕mv第一页| 成人特级黄色片久久久久久久| 一个人免费在线观看电影| 99热精品在线国产| 男人舔女人下体高潮全视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产精品电影一区二区三区| 波多野结衣高清无吗| 男女边吃奶边做爰视频| a级毛色黄片| 内射极品少妇av片p| 深夜a级毛片| 日韩高清综合在线| 午夜精品国产一区二区电影 | 搞女人的毛片| 哪里可以看免费的av片| 又爽又黄a免费视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 午夜精品在线福利| av天堂中文字幕网| 亚洲七黄色美女视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 99热全是精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 欧美精品一区二区大全| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲最大成人中文| av在线天堂中文字幕| 精品国内亚洲2022精品成人| 日日撸夜夜添| 精品久久久久久成人av| 久久99蜜桃精品久久| 成人av在线播放网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲无线观看免费| 久久久久久久午夜电影| 日本一本二区三区精品| 免费av毛片视频| 一级av片app| 国产三级中文精品| 国产片特级美女逼逼视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 99精品在免费线老司机午夜| 久久久久久久久久黄片| 欧美高清性xxxxhd video| 中文欧美无线码| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲电影在线观看av| 色播亚洲综合网| 特级一级黄色大片| 中文字幕熟女人妻在线| 麻豆一二三区av精品| 久久久久久久久久黄片| 日韩欧美国产在线观看| 久久亚洲精品不卡| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国内精品宾馆在线| 人体艺术视频欧美日本| av卡一久久| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美性感艳星| 国产在线男女| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲av免费在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产三级在线视频| 国产视频内射| 亚洲av中文av极速乱| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美三级亚洲精品| 午夜免费激情av| 亚洲av二区三区四区| 两个人视频免费观看高清| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 成人一区二区视频在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲国产精品久久男人天堂| 少妇丰满av| 成年免费大片在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲va在线va天堂va国产| 免费av不卡在线播放| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日韩国内少妇激情av| 超碰av人人做人人爽久久| 午夜视频国产福利| 一边亲一边摸免费视频| 99热精品在线国产| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 看非洲黑人一级黄片| a级毛色黄片| 久久精品人妻少妇| 在线免费观看不下载黄p国产| 成人毛片60女人毛片免费| 给我免费播放毛片高清在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 美女cb高潮喷水在线观看| 综合色丁香网| 亚洲av电影不卡..在线观看| 免费av不卡在线播放| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美极品一区二区三区四区| 小说图片视频综合网站| 深爱激情五月婷婷| 真实男女啪啪啪动态图| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 99久久精品国产国产毛片| 18+在线观看网站| avwww免费| 在线免费十八禁| 亚洲最大成人中文| 亚洲欧洲国产日韩| av国产免费在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久草成人影院| 亚洲成人久久性| 综合色丁香网| 一本精品99久久精品77| 国产精品无大码| 人妻少妇偷人精品九色| 国产高清不卡午夜福利| 我要搜黄色片| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 美女内射精品一级片tv| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 丰满的人妻完整版| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲自拍偷在线| 最近2019中文字幕mv第一页| 免费观看在线日韩| 男女视频在线观看网站免费| 九草在线视频观看| 午夜亚洲福利在线播放| av黄色大香蕉| 婷婷六月久久综合丁香| 国产精品伦人一区二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲图色成人| 亚洲真实伦在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品久久久久久久电影| 69av精品久久久久久| 免费av观看视频| 天堂√8在线中文| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产成人aa在线观看| 免费观看在线日韩| 嫩草影院入口| 99久久九九国产精品国产免费| 一级毛片久久久久久久久女| 久久久久久久久中文| 国产精品一区二区三区四区久久| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲最大成人手机在线| 黄色日韩在线| 亚洲高清免费不卡视频| 国产精品.久久久| 欧美精品国产亚洲| 亚洲在线观看片| 99热只有精品国产| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲美女视频黄频| 国产美女午夜福利| 日本黄大片高清| 99久国产av精品国产电影| 亚洲色图av天堂| 亚洲精品国产成人久久av| 联通29元200g的流量卡| 丰满人妻一区二区三区视频av| 女的被弄到高潮叫床怎么办| av在线观看视频网站免费| 可以在线观看的亚洲视频| 久久久久久久久久久免费av| 最近中文字幕高清免费大全6| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 舔av片在线| 欧美高清性xxxxhd video| 日韩中字成人| 老司机福利观看| 欧美日韩在线观看h| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产极品天堂在线| 麻豆乱淫一区二区| 久久人人精品亚洲av| 99久国产av精品国产电影| 亚洲电影在线观看av| 亚洲av免费高清在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 69av精品久久久久久| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 日韩人妻高清精品专区| 一级毛片我不卡| 插逼视频在线观看| 国产精品久久视频播放| 三级经典国产精品| 卡戴珊不雅视频在线播放| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美激情在线99| 久久久久久久久久久免费av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 欧美色欧美亚洲另类二区| 中文资源天堂在线| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲三级黄色毛片| 国产成年人精品一区二区| 国产av一区在线观看免费| 国产一区二区在线观看日韩| 精品久久久久久成人av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 免费看日本二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲国产色片| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 日韩欧美国产在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日韩一区二区三区影片| 日韩精品青青久久久久久| 久99久视频精品免费| 精品人妻偷拍中文字幕| 成人av在线播放网站| ponron亚洲| 性欧美人与动物交配| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 丝袜喷水一区| av免费在线看不卡| 特大巨黑吊av在线直播| 日本一本二区三区精品| 深夜a级毛片| 麻豆国产av国片精品| 永久网站在线| videossex国产| 欧美不卡视频在线免费观看| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美+日韩+精品| 一级毛片久久久久久久久女| 91狼人影院| 一个人免费在线观看电影| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 中文字幕久久专区| 亚洲av第一区精品v没综合| av.在线天堂| a级毛色黄片| 亚洲综合色惰| 赤兔流量卡办理| av在线天堂中文字幕| 亚洲,欧美,日韩| 精品午夜福利在线看| 国产精品精品国产色婷婷| 麻豆一二三区av精品| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 免费av观看视频| 有码 亚洲区| 最近最新中文字幕大全电影3| 深夜a级毛片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 在线免费观看不下载黄p国产| 神马国产精品三级电影在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 悠悠久久av| 99久久精品国产国产毛片| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 日本三级黄在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲最大成人中文| 午夜亚洲福利在线播放| 九草在线视频观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 女同久久另类99精品国产91| 国产成人影院久久av| 国产一级毛片七仙女欲春2| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 两个人的视频大全免费| 天美传媒精品一区二区| 亚洲在久久综合| 日日摸夜夜添夜夜爱| 在线a可以看的网站| 12—13女人毛片做爰片一| 久久午夜亚洲精品久久| 久久久久久九九精品二区国产| 精品无人区乱码1区二区| 国产免费一级a男人的天堂| 简卡轻食公司| 日韩人妻高清精品专区| 99热6这里只有精品| 神马国产精品三级电影在线观看| 99热全是精品| 亚洲成人精品中文字幕电影| 韩国av在线不卡| 亚洲精品日韩av片在线观看| 内地一区二区视频在线| 99热网站在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 天堂√8在线中文| 在线国产一区二区在线| 深爱激情五月婷婷| 麻豆成人av视频| 国产精品久久视频播放| 亚洲欧美精品专区久久| 最近最新中文字幕大全电影3| 天美传媒精品一区二区| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产精品永久免费网站| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 三级毛片av免费| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲最大成人中文| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 熟女电影av网| 如何舔出高潮| 九九热线精品视视频播放| 中文亚洲av片在线观看爽| 99久国产av精品| 丰满乱子伦码专区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产精品蜜桃在线观看 | 又爽又黄a免费视频| 少妇的逼好多水| 内射极品少妇av片p| 99riav亚洲国产免费| 悠悠久久av| 女人被狂操c到高潮| 久久久成人免费电影| 午夜视频国产福利| 日韩成人av中文字幕在线观看| 看十八女毛片水多多多| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国产真实乱freesex| 久久精品国产自在天天线| 国产成人精品一,二区 | www.av在线官网国产| 免费观看的影片在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 高清在线视频一区二区三区 | 久久精品国产清高在天天线| 精品久久久久久久久久免费视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 小说图片视频综合网站| 欧美xxxx性猛交bbbb|