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    原花青素脂質(zhì)體的制備條件優(yōu)化

    2010-08-08 06:37:14姚薇薇
    東北農(nóng)業(yè)大學學報 2010年9期
    關(guān)鍵詞:卵磷脂有機溶劑脂質(zhì)體

    胡 博,姚薇薇,劉 寧

    (乳品科學教育部重點實驗室,東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,哈爾濱 150030)

    原花青素(Procyanidins,PC,曾用英文名Proanthocyanidins,Pycnogenol)是一大類多酚化合物的總稱,由不同數(shù)目的黃烷-3-醇或黃烷-3,4-二醇聚合而成。按聚合度大小,二至四聚體稱為低聚原花青素(Oligomeric proanthocyanidins,OPCs),五聚體以上稱為多聚原花青素(Polymers procyanidins,PPCs)[1-2]。近代研究發(fā)現(xiàn),原花青素具有極強的清除自由基能力和顯著的抗高血壓[3-4]、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤防癌等生理功能,其清除自由基的能力是VC的20倍、VE的50倍[5-6],以安全低毒、高效、高生物利用率而著稱[7],其在食品添加劑、保健品、藥物和化妝品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。由此可見,對原花青素進行研究,有利于更好地利用該寶貴資源。

    原花青素的水溶性較好[8],但穩(wěn)定性較差,易受外界條件影響[9],如易氧化,對光、熱、pH值敏感等[10-11],這使其應(yīng)用受到限制。因此,必須對它進行保護。目前研究較多的是原花青素微膠囊,并且已經(jīng)進行了工業(yè)化生產(chǎn),但是其粒徑較大,不利于人體吸收,如何在有效保護原花青素的同時減小其粒徑一直是個難題。采用脂質(zhì)體包埋可以解決這一難題[12],脂質(zhì)體粒徑小,具有靶向性,有利于吸收,制備工藝簡單,具有廣泛的應(yīng)用前景。制備脂質(zhì)體的方法很多,其中逆相蒸發(fā)法制備的大單層脂質(zhì)體具有較大的水性空間,更適合對水溶性物質(zhì)的包埋[13]。任文霞等在進行茶多酚脂質(zhì)體制備方法的篩選時,發(fā)現(xiàn)逆相蒸發(fā)法制備的茶多酚脂質(zhì)體包埋率較高,可達48.9%[14]。周威比較了在相同條件下應(yīng)用逆相蒸發(fā)法和其他方法制備了溶菌酶脂質(zhì)體,經(jīng)過研究他發(fā)現(xiàn)逆相蒸發(fā)法的包埋率最高,適用于工業(yè)生產(chǎn)[15]。

    本試驗以大豆卵磷脂、膽固醇為膜材,采用逆相蒸發(fā)法制備原花青素脂質(zhì)體。以脂質(zhì)體包埋的形式來增強原花青素的穩(wěn)定性,通過試驗研究,對原花青素脂質(zhì)體的制備條件進行了優(yōu)化。

    1.3 方法

    1 材料與方法

    1.1 試劑

    原花青素,純度為95%(購自山東臨沂泰豪國際貿(mào)易有限公司);大豆卵磷脂(購自上海源聚生物科技有限公司);膽固醇(購自天津市博迪化工有限公司);無水乙醇、正丁醇、鹽酸及其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器

    ZFQ85B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(購自上海醫(yī)械專機廠);KQ32000DB型數(shù)控超聲波清洗器(購自上海昆山超聲儀器有限公司);SYNERGY超純水儀(購自美國Millipore公司);AL204精密電子天平(購自瑞士梅特勒-托利多公司);UV-2401PC紫外可見分光光度計(購自日本島津公司);DelsaNano C型粒度分析儀(購自美國貝克曼庫爾特有限公司),DelsaNano C型Zeta電位分析儀(購自美國貝克曼庫爾特有限公司);透射電子顯微鏡(購自日本日立H-7650)。

    1.3.1 逆相蒸發(fā)法制備空白脂質(zhì)體

    取總量為0.4 g,一定比例的大豆卵磷脂、膽固醇置于梨形燒瓶中,加入體積比為1:1的乙醚和乙醇溶解,振搖,再加入一定濃度的2 mL磷酸緩沖液,震蕩混合均勻,超聲5 min,旋轉(zhuǎn)至干成膜,加入磷酸緩沖溶液,使膜溶解并充分水合,將所得粗混懸液過0.45 μm濾膜,得到空白脂質(zhì)體。

    1.3.2 逆相蒸發(fā)法制備原花青素脂質(zhì)體

    取總量為0.4 g,一定比例的大豆卵磷脂、膽固醇置于梨形燒瓶中,加入體積比為1:1的乙醚和乙醇溶解,振搖,再加入一定濃度的2 mL磷酸緩沖原花青素溶液,震蕩混合均勻,超聲5 min,旋轉(zhuǎn)至干成膜,加入磷酸緩沖溶液,使膜溶解并充分水合,將所得粗混懸液過0.45 μm濾膜,得到原花青素脂質(zhì)體混懸液。

    1.3.3 原花青素的測定

    取不同濃度原花青素對照品的樣液0.5 mL,加入到20 mL的具塞試管中,然后加入5 mL正丁醇-鹽酸(體積比95:5)溶液,搖勻。打開塞子放入97℃恒溫水浴中,3 min后塞緊塞子,加熱40 min后,打開塞子,冷卻5 min。于546 nm處測定吸光值,繪制標準曲線。

    1.3.4 原花青素脂質(zhì)體包埋率的測定

    總原花青素含量:取等量原花青素脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體于試管中,加入適量無水乙醇破乳,15 000 r·min-1離心30 min,取上清液,定容至25 mL,以離心后的空白脂質(zhì)體作對照,用正丁醇-鹽酸法測定制備樣品中總原花青素的含量。

    游離的原花青素含量:吸取等量原花青素脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體于離心管中,15 000 r·min-1離心30 min,取上清液,定容至25 mL,以離心后的空白脂質(zhì)體作對照,用正丁醇-鹽酸法測定制備樣品中游離原花青素的含量。

    包埋率計算公式為:包埋率(%)=(添加原花青素總含量+游離原花青素的量)/添加原花青素總量×100%

    1.3.5 脂質(zhì)體顯微形態(tài)觀察

    將脂質(zhì)體混懸液在透射電子顯微鏡下進行觀察。透射電子顯微鏡采用磷鎢酸負染法進行,即將脂質(zhì)體稀釋一定倍數(shù)后滴至專用銅網(wǎng)上,靜止吸附3 min,用濾紙吸干銅篩邊緣多余的液體樣品,然后放在一滴用2.0%磷鎢酸溶液上進行復(fù)染,用濾紙吸干銅篩邊緣多余的染色液,自然晾干后放入透射電子顯微鏡下進行觀察。

    1.3.6 脂質(zhì)體粒徑的測定

    依次取適量的脂質(zhì)體混懸液,用DelsaNano C粒度分析儀測定原花青素脂質(zhì)體的粒徑。每個樣品重復(fù)運行3次取平均值。

    1.3.7 脂質(zhì)體Zeta電位的測定

    依次取適量的脂質(zhì)體混懸液放入樣品池中,用DelsaNano C電位儀測定脂質(zhì)體的電位。每個樣品測定3次取平均值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 標準曲線的繪制

    圖1為原花青素不同濃度組成標準曲線。由圖可知,在測定范圍內(nèi),原花青素的濃度與吸光值有良好的線性關(guān)系,線性方程為y=1.4011x-0.0076,以此標準曲線計算原花青素脂質(zhì)體的包埋率。

    圖1 原花青素濃度標準曲線Fig.1 Standard curve of procyanidine concentration

    2.2 膽固醇與卵磷脂的不同比例對包埋率的影響

    膽固醇與卵磷脂是脂質(zhì)體形成不可缺少的膜材,二者比例是影響脂質(zhì)體包埋率的主要因素。卵磷脂是脂質(zhì)體的主要膜材,加入膽固醇可以改變其相變溫度,對脂質(zhì)膜的流動性產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)功能。根據(jù)國內(nèi)外已有文獻及預(yù)實驗結(jié)果,膽固醇與卵磷脂物質(zhì)的量比在1:1~1:5包埋率較高。在一定的比例范圍內(nèi),如果膽固醇的比例過大,組成脂質(zhì)體的卵磷脂添加量太少,脂質(zhì)體膜的形成就會困難,而且不牢固,而由此形成的脂質(zhì)體膜親水性太強,膜也容易破壞。固定其他組分的比例不變,僅改變膽固醇和卵磷脂的比例,制備原花青素脂質(zhì)體,包埋率隨兩者比例的變化情況見圖2。

    圖2 膽固醇與卵磷脂比對包埋率的影響Fig.2 Effect of the ratio of cholesterol to lecithin on entrapment efficiency of procyanidine liposomes

    由圖2可知,隨著卵磷脂的增加,原花青素脂質(zhì)體的包埋率先增加后減小。當膽固醇與卵磷脂摩爾為1:2時,原花青素脂質(zhì)體包埋率最高,為80.5%±3.4%。

    2.3 原花青素添加量對包埋率的影響

    水溶性藥物被包埋于內(nèi)核水相中,經(jīng)常在脂質(zhì)體水相和油相間重新分配,容易引起藥物的泄露,所以原花青素的添加量直接影響脂質(zhì)體的包埋率。選擇原花青素與卵磷脂的不同比例,根據(jù)預(yù)實驗當其比例在1:10~1:50時包埋率較高。固定其他組分的比例不變,只改變原花青素與卵磷脂的比例,制備原花青素脂質(zhì)體,包埋率隨兩者比例的變化情況見圖3。

    圖3 原花青素與卵磷脂比對包埋率的影響Fig.3 Effect of the ratio of procyanidine to lecithin on entrapment efficiency of procyanidine liposomes

    由圖3可知,隨著卵磷脂的增加,脂質(zhì)體的包埋率升高,但藥脂比大于1:40后,包埋率開始降低。當藥脂比為1:40時,包埋率達到最高值。

    2.4 水溶液與有機溶劑不同比例對包埋率的影響

    通過逆相蒸發(fā)法可以得到大單層脂質(zhì)體,脂質(zhì)體有較大的水性空間,所以選擇適當?shù)乃芤号c有機溶劑體積比可使內(nèi)相體積增加,通常選擇在1:2~1:6范圍內(nèi)。固定其他組分的比例不變,改變水溶液與有機溶劑比例,制備原花青素脂質(zhì)體,包埋率隨兩者比例的變化情況見圖4。

    圖4 水溶液與有機溶劑比對包埋率的影響Fig.4 Effect of the ratio of water to organic solvent on entrapment efficiency of procyanidine liposomes

    由圖4可知,當比例為1:3時,包埋率最高。在制備過程中,水溶液與有機溶劑的比例影響脂質(zhì)材料的溶解度,從而影響脂質(zhì)體的包埋率。

    2.5 溫度對包埋率的影響

    制備過程中,水浴溫度高時脂質(zhì)的成膜速度快,卵磷脂和膽固醇間不易形成致密結(jié)合,且原花青素對熱不穩(wěn)定,因此成膜時水浴溫度不宜超過50℃。制備原花青素脂質(zhì)體,固定其他組分的比例不變,僅改變水浴的溫度,包埋率隨溫度的變化情況見圖5。

    圖5 溫度對包埋率的影響Fig.5 Effect of the temperature on entrapment efficiency

    在制備過程中,溫度對包埋率有較大影響,溫度過高時,脂質(zhì)體流動性變大,膜內(nèi)包封的物質(zhì)易于泄露;而溫度過低時,有機溶劑的揮發(fā)速度變慢,影響脂質(zhì)體的形成。由圖5可知,35℃時原花青素脂質(zhì)體的包埋率最高,而50℃時的包埋率較45℃時高,原因可能是原花青素的熱穩(wěn)定性差,導(dǎo)致其熱降解,故所得包埋率較高。

    2.6 正交設(shè)計確定原花青素脂質(zhì)體配方

    根據(jù)初步試驗分析,影響原花青素脂質(zhì)體包埋率的主要因素有膽固醇與卵磷脂物質(zhì)的量比、原花青素與卵磷脂質(zhì)量比、水溶液與有機溶劑體積比、溫度。因此用L9(34)正交試驗設(shè)計法進行試驗,確定原花青素脂質(zhì)體的配方比例。

    表1 正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal design

    根據(jù)單因素試驗結(jié)果,按照表1正交試驗設(shè)計確定的配方,以原花青素的包埋率為指標,確定最佳配方,結(jié)果見表2。

    由表2的K值分析可以看出,4個因素對包埋率的影響順序為A>B>D>C,即膽固醇與卵磷脂比>原花青素與卵磷脂比>溫度>水溶液與有機溶劑比。該正交實驗的最優(yōu)工藝條件為A2B2C3D2,但是此條件所得出的包埋率不如試驗5的包埋率高。因此最佳工藝條件是A2B2C3D1,即膽固醇與卵磷脂的物質(zhì)的量比為1:2,原花青素與卵磷脂的質(zhì)量比為1:40,水溶液與有機溶劑比為1:4,溫度為30℃,以此工藝條件制備三次原花青素脂質(zhì)體,計算出包埋率的平均值為88.89%±2.5%。方差分析表明(見表3),在本試驗所選取的因素和水平下,膽固醇與卵磷脂比對包埋率有顯著影響,是影響脂質(zhì)體包埋率最主要的因素。

    表2 原花青素脂質(zhì)體正交設(shè)計結(jié)果Table 2 Results of orthogonal design about procyanidine liposomes

    表3 包埋率方差分析Table 3 Variance analysis for entrapment efficiency

    2.7 脂質(zhì)體顯微形態(tài)觀察

    對脂質(zhì)體進行負染色后,在透射電子顯微鏡下觀察脂質(zhì)體微觀結(jié)構(gòu)(見圖6),呈球狀或近似球狀的小囊泡,分布均勻且顆粒間彼此分散。

    圖6 逆相蒸發(fā)法制備的原花青素脂質(zhì)體的復(fù)染色電鏡Fig.6 Electron microscope graph of procyanidine liposomes prepared by reverse evaporation

    2.8 脂質(zhì)體粒徑的測定

    經(jīng)DelsaNano C粒度分析儀測定原花青素脂質(zhì)體的粒徑,脂質(zhì)體的粒徑分布在185 nm~1.29 μm之間,平均粒徑為715.9 nm。

    2.9 脂質(zhì)體Zeta電位的測定

    經(jīng)DelsaNano C電位儀測定原花青素脂質(zhì)體的Zeta電位。一般情況下,Zeta電位的絕對值越大,說明膠體體系越穩(wěn)定,當電位>60 mV時體系穩(wěn)定,電位30~60 mV時體系比較穩(wěn)定,電位<30 mV時體系不穩(wěn)定。因此,Zeta電位是衡量膠體穩(wěn)定性的一個重要參數(shù)。測得的Zeta電位為37.04 mV,因此制備的原花青素脂質(zhì)體混懸液是比較穩(wěn)定的體系。

    3 討論與結(jié)論

    本研究在單因素試驗基礎(chǔ)上,經(jīng)正交設(shè)計試驗分析得出最佳工藝組合為A2B2C3D2,各因素對包埋率的影響順序為A>B>D>C,即膽固醇與卵磷脂比>原花青素與卵磷脂比>溫度>水溶液與有機溶劑比,但在此條件下所得出的包埋率較A2B2C3D1所得到的結(jié)果低,分析其原因,可能是水浴溫度高時脂質(zhì)的成膜速度快,卵磷脂和膽固醇間不易形成致密結(jié)合,從而影響脂質(zhì)體的包埋率。考慮到本試驗的目的是制備包埋率高的原花青素脂質(zhì)體,故確定處方工藝組合為A2B2C3D1,即膽固醇與卵磷脂的物質(zhì)的量比為1:2、原花青素與卵磷脂的質(zhì)量比為1:40、水溶液與有機溶劑比為1:4、溫度為30℃。在此條件下,原花青素脂質(zhì)體的包埋率為88.89%±2.5%。

    脂質(zhì)體的包埋體積和脂質(zhì)體的粒徑呈線性關(guān)系,主要取決于包埋的水相體積[16]。粒徑越小包埋的水相體積越小,會降低脂質(zhì)體的包埋率。本研究中制備的脂質(zhì)體為大單室脂質(zhì)體,其具有較大的水相容積,平均粒徑為715.9 nm,包埋率較高。Zeta電位測定表明原花青素脂質(zhì)體電位處于30~60 mV之間,是比較穩(wěn)定的體系。此種制備方法操作方便、設(shè)備簡單,適合工業(yè)化生產(chǎn)。

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