川芎嗪對熱應激所致豬睪丸細胞內(nèi)活性氧水平的影響

張曉峰,劉 迪,李 垚

(1.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.哈爾濱醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院,黑龍江 哈爾濱 150081)

由于畜禽飼養(yǎng)密度相對過大,使飼養(yǎng)環(huán)境溫度升高,由此導致的動物熱應激(heat stress)給養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失。熱應激對動物繁殖性能的負面影響引起了國內(nèi)外學者的廣泛關注,但熱應激對畜禽繁殖性能不良影響的機理尚不十分清楚。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是從川芎的干燥根莖中提取的一種生物堿單體,其化學結(jié)構(gòu)為4-甲基吡嗪,具有抗血小板聚集、擴張血管、保護血管內(nèi)皮、改善微循環(huán)等多種藥理作用,用于部分心腦血管等疾病的治療并取得良好療效[1];TMP同時還具有抗氧化、抑制和清除自由基產(chǎn)生、提高內(nèi)源性超氧化物歧化酶活性等生物作用,但其作用機制尚未闡明[2]。正常生理情況下,體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài),當動物受到應激時,會使自由基產(chǎn)生增加,而自由基清除體系能力不足,造成體內(nèi)自由基蓄積,導致組織氧化損傷。本研究以豬睪丸細胞為研究對象,以活性氧(reactive oxygen species,ROS)為著眼點,探討TMP對熱應激所致細胞氧化損傷的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 川芎嗪購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司,純度98%,白色針狀結(jié)晶,溶于60°C熱水中;MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司;小牛血清購自上海緯群生物技術(shù)有限公司;EDTA/胰酶和MT T購自美國Sigma公司;活性氧檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;流式細胞儀(Beckman,美國);電熱鼓風干燥箱(泰斯特,中國)。

1.2 細胞培養(yǎng) 豬睪丸(ST)細胞由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所王永博士惠贈。細胞在37°C、5%CO2條件下培養(yǎng)于含 10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基中,EDTA/胰酶消化、傳代,取對數(shù)生長期細胞用于試驗。

1.3 細胞分組與處理 試驗設熱應激組、TMP組、熱應激+TMP組、陰性對照組。熱應激組細胞置于電熱干燥箱中43°C恒溫烘烤;熱應激+TMP組細胞先加入TMP預培養(yǎng)12 h后,再43°C恒溫烘烤;TMP組細胞試驗結(jié)束前12 h加入TMP;陰性對照組細胞不做任何處理。

1.4 細胞毒性檢測(MT T分析法) 將細胞接種于96孔培養(yǎng)板(1×104/孔),培養(yǎng)24 h后按上述方法處理細胞,另設陰性對照組和空白對照組,每組6個重復孔。培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MT T(5 mg/mL,20μL/孔),培養(yǎng)結(jié)束后棄去液體 ,加入DMSO(150μL/孔)震蕩混勻,于酶標儀490 nm波長測定吸光度(OD)值,計算抑制率。

1.5 細胞活性氧檢測 按試劑盒說明書操作。2×104細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中,按上述方法處理細胞后,采用原位裝載探針的方法,加入DCFH-DA(終濃度 3.3 μ mol/L)37°C 孵育 20 min,用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次,收集細胞懸浮于PBS中流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 熱應激及TMP細胞毒性作用 在本試驗條件下,熱應激、TMP及兩者聯(lián)合作用細胞后,均未見明顯的細胞毒性作用,試驗結(jié)果見圖1。

2.2 熱應激及TMP對細胞內(nèi)活性氧水平影響43℃作用細胞1 h,細胞內(nèi)ROS水平與對照組比較未見明顯升高(P＞0.05),但43℃作用2 h細胞內(nèi)ROS水平顯著升高(P＜0.05)。160μg/mL和320μg/mL TMP能顯著抑制熱應激所致細胞內(nèi) ROS水平的升高,結(jié)果見圖2。

3 討論

ROS是指含氧的自由基,是細胞氧化磷酸化過程氧的代謝副產(chǎn)物,是一類有高度化學反應活性的含氧基團,包括羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O-2·)、單線態(tài)氧(O2)及過氧化氫(H2O2)等[3]。ROS容易與生物大分子發(fā)生反應,導致細胞結(jié)構(gòu)的破壞,影響機體正常細胞和組織的功能,從而引起多種疾病。過量ROS生成時會對生殖細胞產(chǎn)生損傷作用,攻擊細胞膜及脂蛋白中的多元不飽和脂肪酸,導致細胞膜流動性下降和脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)和DNA破壞或參與誘導生殖細胞發(fā)生凋亡,從而直接和間接影響畜禽的繁殖功能[4-5]。有研究表明,ROS與精子畸形率有極密切的關系,ROS產(chǎn)生過量過多時,形態(tài)異常以及活動性差的精子數(shù)量則會增多[6]。本研究結(jié)果表明,熱應激作用細胞1 h,細胞內(nèi)ROS水平未發(fā)生顯著變化,但作用細胞2 h,細胞內(nèi)ROS水平顯著升高,提示熱應激能誘發(fā)睪丸細胞內(nèi)ROS生成,進而可能會影響睪丸細胞的生精功能。在脫離熱應激源后,隨著時間延長,睪丸細胞內(nèi)ROS水平如何變化,我們將在以后的研究中進一步探討。另外,在本研究中,我們觀察了TMP對細胞氧化損傷的保護作用,結(jié)果表明 TMP能顯著抑制熱應激所致的細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,具有劑量-效應關系,進一步證明了TMP具有抗氧化、抑制自由基的作用,同時也為探尋抗熱應激劑提供了研發(fā)方向。我們曾試圖檢測細胞培養(yǎng)液中參與機體氧化和抗氧化反應的酶的變化,但由于試驗方法檢測靈敏度的限制,而沒有成功。

綜上所述,熱應激能使睪丸細胞內(nèi)活性氧生成增加,誘發(fā)氧化損傷,川芎嗪能顯著抑制熱應激所致的睪丸細胞內(nèi)活性氧的生成,具有抗氧化損傷作用。

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