廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌的分離鑒定

何麗麗,李春玲,王貴平,賈愛卿,楊冬霞,宣春玲,鄭鐵鎖,王金生

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室,廣東 廣州 510640;2.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,江蘇 南京 210095)

副豬嗜血桿菌病又稱豬格氏病,主要引起豬的纖維素性多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎,甚至腦炎,其病原為副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,Hps)。此病過去一直被認為是仔豬的一種散發(fā)性、應激性疾病。但是近年來,隨著養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展,越來越多的高健康豬群或SPF豬群的出現(xiàn),這些豬如果處于一種未免疫狀態(tài),一旦Hps入侵,就會受到嚴重感染,甚至死亡。各種日齡的豬均可感染[1]。Turni C等[2]研究表明副豬嗜血桿菌病的發(fā)病率可達50%～70%,死亡率可達10%以上。近年來,美國、日本、加拿大、德國、澳大利亞、丹麥、西班牙等養(yǎng)豬業(yè)較發(fā)達的國家均已對本國的副豬嗜血桿菌病的流行情況進行了調(diào)查,結(jié)果顯示副豬嗜血桿菌從臨床發(fā)病豬中的分離率可達20%,而且流行的副豬嗜血桿菌血清型通常為毒力較強的血清型,如血清5型、4型和13型等[3],這些血清型在我國絕大多數(shù)豬場也存在和流行。目前,副豬嗜血桿菌已成為影響世界畜牧業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的重要致病菌,受到越來越多的關(guān)注。在我國,近年來由副豬嗜血桿菌引起豬的漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報道越來越多,此病給養(yǎng)豬業(yè)帶來了慘重的經(jīng)濟損失。為了解廣東地區(qū)豬場中副豬嗜血桿菌的感染狀況,課題組對廣東省部分豬場送檢病料進行了副豬嗜血桿菌分離和鑒定,將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品 2007年9月～2008年9月,從廣東地區(qū)37個發(fā)病豬場送檢病豬中采集病料372份,采集部位包括心、心血、肺 、肝、脾 、腎、腦、扁桃體 、淋巴結(jié)、心包積液、關(guān)節(jié)液。

1.2 主要試劑 10×Buffer、dNTPs、Taq酶購自TaKaRa公司;TSA、TSB培養(yǎng)基購自Oxioid公司;微量生化管、藥敏紙片均購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 細菌分離 無菌取病變組織,分別接種于TSA、TSB培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)16～18 h。

1.4 涂片鏡檢 挑取平板上典型的單個菌落涂片,革蘭染色后在油鏡下觀察細菌形態(tài)。

1.5 PCR擴增反應 根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA序列設計引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成,序列分別為:

上游 :5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′

下游 :5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′

預期擴增片段大小為822 bp。

1.6 生化鑒定 采用微量生化管法,取單菌落純培養(yǎng)后分別接種于果糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、木糖、L-阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、吲哚、脲酶、蔗糖等微型生化鑒定管[4],接種前先在生化管里加入V因子,同時做觸酶試驗。

1.7 耐藥性檢測 根據(jù)2000年美國NCCLS所建議的藥敏試驗藥物選擇規(guī)則選取藥敏紙片,用無菌鑷子夾無菌棉花蘸取副豬嗜血桿菌TSB培養(yǎng)物,涂布接種于TSA平板上,待稍干后,用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼于培養(yǎng)基表面,37℃培養(yǎng)20～24 h后,測量抑菌圈直徑,根據(jù)美國NCCLS細菌藥物敏感試驗判定標準判定結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計處理 統(tǒng)計副豬嗜血桿菌分離率、豬場陽性感染率及不同時間、不同地區(qū)的分離率等。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離與鑒定 分離菌為革蘭陰性,具多形性,從短桿狀到細絲狀;TSA固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16～24 h后,菌落透明、光滑濕潤,具有藍色熒光,見圖1。PCR鑒定結(jié)果見圖2。

圖1 Hps在TSA平板上的菌落形態(tài)

2.2 副豬嗜血桿菌的分離結(jié)果 2007年9月～2008年9月,共檢測病料372份,PCR擴增副豬嗜血桿菌陽性52份,但只有39份病料中分離到副豬嗜血桿菌,實際分離率(10.48%)要低于PCR檢出率(13.98%);來源于廣東地區(qū)37個豬場的125頭發(fā)病豬中,從30頭病豬都分離到副豬嗜血桿菌,分離率可達24.00%。

圖2 Hps分離株16S rRNA PCR擴增結(jié)果

2.2.1 不同時間副豬嗜血桿菌的檢出情況 副豬嗜血桿菌病在2007年12月～2008年2月發(fā)病率較高,而3～9月發(fā)病率相對較低,此病發(fā)生可能與氣候有關(guān),該病于秋、冬季發(fā)病率要高于春、夏季,見表1。

表1 不同時間副豬嗜血桿菌的檢出情況

2.2.2 廣東省不同地區(qū)副豬嗜血桿菌檢出情況從37個發(fā)病豬場中,共檢測出副豬嗜血桿菌陽性豬場15個,豬場平均陽性率達40.54%,說明副豬嗜血桿菌病在廣東地區(qū)已普遍流行;而且以粵東地區(qū)最高,這可能與這些地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)比較發(fā)達、豬場規(guī)模化和集約化程度高有關(guān),見表2。

表2 廣東省不同地區(qū)副豬嗜血桿菌檢出情況

2.3 副豬嗜血桿菌分離株生化鑒定 多數(shù)副豬嗜血桿菌分離株只發(fā)酵果糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖,觸酶陽性,不發(fā)酵棉籽糖和吲哚等,見表3。

2.4 副豬嗜血桿菌分離株藥敏試驗 23株副豬嗜血桿菌分離株對頭孢氨噻肟、頭孢曲松鈉、阿奇霉素、氟苯尼考、強力霉素、左氟沙星等抗生素敏感;對阿莫西林、先鋒霉素Ⅴ中度敏感;而對復方新諾明、磺胺異惡唑、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、丙氟哌酸、恩諾沙星等耐藥,見表4。

3 討論

副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道(鼻腔、扁桃體和氣管前段等)的常在菌,但是在不利的飼養(yǎng)環(huán)境下,它能夠侵入宿主其他器官,引起豬的格氏病,屬于一種條件性致病菌[5]。副豬嗜血桿菌病通常引起豬的漿液纖維素性甚至膿性纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦炎、敗血癥伴隨卡他性支氣管肺炎,臨床癥狀包括高燒(41.5℃)、咳嗽、腹式呼吸、關(guān)節(jié)腫脹和一些中樞神經(jīng)癥狀,如側(cè)臥、震顫[6],影響豬的生長,也能導致豬的突然死亡。本研究所調(diào)查的副豬嗜血桿菌發(fā)病豬場,主要表現(xiàn)為豬的關(guān)節(jié)腫脹、咳嗽、全身發(fā)紅,剖檢觀察,可以發(fā)現(xiàn)大多數(shù)病豬心包積液、胸腔積液、心臟表面包裹一層纖維素性滲出物、血凝不良、肺間質(zhì)增寬;或者肺臟肉樣變、肺與心包粘連、扁桃體充血、關(guān)節(jié)有漿液性或者膿性滲出物,部分病豬腦部充血、水腫積液。

表3 部分副豬嗜血桿菌分離株生化鑒定結(jié)果

表4 23株副豬嗜血桿菌分離株耐藥情況

從2007年9月～2008年 9月,共檢測 125頭患病豬,從其中的30頭病豬體內(nèi)分離到副豬嗜血桿菌,分離率達24.00%;從372份病料中的39份病料分離到副豬嗜血桿菌(不包括扁桃體、鼻拭子),病料分離率達10.48%,豬場平均陽性率達40.54%,與國內(nèi)外報道相似[7]。而且副豬嗜血桿菌陽性豬場都不同程度的伴有繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒、偽狂犬病病毒、豬瘟病毒的感染。

副豬嗜血桿菌是V因子依賴菌,對生長條件要求比較苛刻,分離比較困難,作者通過分離發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌從心臟、肺臟的分離率高于從心包積液、關(guān)節(jié)液的分離率,病料超過12 h或使用過比較多的抗生素治療的病豬,副豬嗜血桿菌的分離率就會更低。副豬嗜血桿菌在培養(yǎng)過程中很容易污染,保存時間短,因此要注意進行副豬嗜血桿菌的純化與鑒定。

副豬嗜血桿菌病在規(guī)?；呢i場暴發(fā)的頻率越來越高,但到目前為止,副豬嗜血桿菌的毒力因子、副豬嗜血桿菌病的發(fā)病機理等尚不清楚。而HPS的血清型眾多,血清型之間缺乏有效的交叉保護,副豬嗜血桿菌又具有明顯的地方特征,因此,開展不同地區(qū)副豬嗜血桿菌的流行病學調(diào)查,了解其流行的主要血清型,以研制出適合當?shù)厥褂玫囊呙?對于有效的控制和預防該病至關(guān)重要[8-9]。

[1]Peter Kielstein,Vicki J Rapp-Gabrielson.Designation of 15 Serovars of Haemophilus parasuis on the Basis of Immunodiffusion Using Heat-Stable Antigen Extractst[J].American Society for Microbiology,1992,30(4):862-865.

[2]T urni C,Blackall P J.Comparison of sampling sites and detection methods for Haemophilus parasuis[J].Australian Veterinary Journal Volum,2007(5):177-184.

[3]Maclnnes J I,Desrosiers R.Agents of the “Suis-ide Diseases”of Swine:Actinobacillus suis,Haemophilus parasuis,and Streptococcus suis[J].Can J Vet Res,1999,63:83-89.

[4]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001:125.

[5]瞿曉蘭,陳小玲.副豬嗜血桿菌病[J].動物醫(yī)學進展,2006,27(3):99-101.

[6]Marta Cerda-Cuellar,Virginia Aragon.Serum-resistance in Haemophilus parasuis is associated with systemic disease in swine[J].T he Veterinary Journal,2008,175:384-389.

[7]尹秀鳳,王艷,姜平,等.副豬嗜血桿菌PCR檢測方法的建立與應用[J].中國獸醫(yī)學報,2007,27(2):180-183.

[8]華升,梅書棋,曾德芳.副豬嗜血桿菌病研究進展[J].動物醫(yī)學進展,2006,27(11):7-10.

[9]冼瓊珍,黃耿森,王淑敏,等.副豬嗜血桿菌的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志,2006,42(3):27-28.