HPLC 法測(cè)定甲狀旁腺激素（1-34）原料藥的含量

陳 秀，韓方璇，黃春新（海南省人民醫(yī)院藥學(xué)部，?？谑?570102）

甲狀旁腺激素（1-34）（以下簡(jiǎn)稱PTH（1-34））注射劑是由美國(guó)禮來(lái)公司開(kāi)發(fā)用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，并于2002年在美國(guó)、丹麥和芬蘭等國(guó)上市（商品名為Forteo）[1]。PTH（1-34）用于治療具有高風(fēng)險(xiǎn)骨折性的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，能增加骨密度并降低脊椎與非脊椎骨折的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)也可以用于提高男性患有原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥或性腺功能減退的骨質(zhì)疏松癥的骨量[2]。該藥治療對(duì)象包括具有骨質(zhì)疏松引發(fā)骨折病史的患者，或有多種誘發(fā)骨折的風(fēng)險(xiǎn)及以往的針對(duì)骨質(zhì)疏松癥治療方法對(duì)其失敗或無(wú)法耐受的患者[2～5]。國(guó)內(nèi)已有文獻(xiàn)[6]報(bào)道PTH（1-34）的含量測(cè)定方法，該方法為高效液相色譜（HPLC）法，但存在一定缺陷：（1）分析時(shí)間較長(zhǎng)，約40 min；（2）以0.1%的三氟乙酸（TFA）乙腈溶液為流動(dòng)相，酸性較強(qiáng)，pH小于2，易損壞色譜柱；（3）采用梯度洗脫方法，對(duì)色譜柱要求較高，且基線不平，峰形不好。為了克服上述分析結(jié)果的缺點(diǎn)，筆者經(jīng)多次篩選，在其基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，最后確定采用在水相中加入鹽、有機(jī)相采用甲醇為流動(dòng)相及等度洗脫的HPLC法，用于測(cè)定PTH（1-34）原料藥的含量。結(jié)果表明，該方法的各項(xiàng)方法學(xué)研究各項(xiàng)指標(biāo)均能達(dá)到要求。

1 儀器與試藥

UV-260紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；HP1100型HPLC儀、二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)惠普公司）。

PTH（1-34）對(duì)照品（美國(guó) Peptide公司，批號(hào)：M 09245A1，經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定含量為99.8%）；PTH（1-34）原料藥（杭州諾泰制藥有限公司，批號(hào)：090601、090602、090603，經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定純度分別為98.7%、99.2%、99.6%）；硫酸鈉為分析純，甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Spherisorb ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.05 mol·L－1Na2SO4水溶液（磷酸調(diào)節(jié)至pH 2.5），A∶B＝30∶70，流速為1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量為20 μL。理論板數(shù)按PTH（1-34）峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2 溶液的制備

供試品溶液：取本品適量加水溶解，稀釋至每1 mL中約含PTH（1-34）0.1 mg的溶液，即得。

對(duì)照品溶液：取經(jīng)干燥至恒重的PTH（1-34）對(duì)照品適量加水溶解，制備成每1 mL中約含PTH（1-34）0.1 mg的溶液，即得。

2.3 波長(zhǎng)的確定

利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在190～760 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明PTH（1-34）在210、280 nm波長(zhǎng)處均有吸收峰。通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器在線掃描發(fā)現(xiàn)主要雜質(zhì)峰在210、280 nm波長(zhǎng)處均不明顯，但在215 nm波長(zhǎng)處雜質(zhì)峰和主峰都比較明顯，在藥品標(biāo)準(zhǔn)的建立時(shí)考慮到有關(guān)物質(zhì)和主藥含量的同時(shí)測(cè)定，更有利于檢測(cè)的方便，故確定測(cè)定波長(zhǎng)為215 nm。經(jīng)驗(yàn)證，在該波長(zhǎng)下能夠達(dá)到含量測(cè)定的靈敏度要求。

2.4 流動(dòng)相的確定

有機(jī)流動(dòng)相的選擇：反相色譜常采用的有機(jī)流動(dòng)相為甲醇和乙腈，甲醇的截止波長(zhǎng)（205 nm）和乙腈的截止波長(zhǎng)（190 nm）都小于測(cè)定波長(zhǎng)，但考慮到甲醇價(jià)格低廉，所以選甲醇作為有機(jī)流動(dòng)相[7]。

鹽種類的選擇：加入水相中的鹽筆者先后選擇了磷酸鈉、磷酸二氫鈉、氯化銨和醋酸鈉等緩沖鹽并調(diào)節(jié)緩沖鹽的濃度，改變水相與流動(dòng)相的配比，結(jié)果PTH（1-34）的峰形和分離效果都不好。后來(lái)在水相中加入中性鹽硫酸鈉，并用磷酸調(diào)節(jié)pH值，結(jié)果峰形和分離效果得到了很大的改善。為了得到合適的保留時(shí)間、最好的峰形和分離效果，進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)，試驗(yàn)內(nèi)容包括流動(dòng)相的pH值以及水相與有機(jī)相的配比。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相的pH值、有機(jī)相與水相的配比篩選結(jié)果Tab 1 pH value of mobile phase and proportion screening of water phase and organic phase

從表1可以看出：流動(dòng)相pH值在2.0時(shí)峰形較寬，基線不平，峰形拖尾；流動(dòng)相pH值為2.5時(shí)基線平穩(wěn)，峰形窄，沒(méi)有雜質(zhì)峰；當(dāng)流動(dòng)相pH值3.0時(shí)峰形較寬，而且在3 min左右出現(xiàn)1個(gè)小的雜質(zhì)峰，所以水相的pH值最后確定為2.5。

對(duì)于流動(dòng)相比例，當(dāng)有機(jī)相甲醇量為15%、水相量為85%時(shí)，主峰保留時(shí)間較長(zhǎng)，為12.583 min，這樣不僅浪費(fèi)時(shí)間，而且也浪費(fèi)昂貴的試劑；而當(dāng)甲醇量增加到35%、水相量減少到65%時(shí)，主峰保留時(shí)間太短，主峰理論板數(shù)達(dá)不到要求，也不利于雜質(zhì)的分離。當(dāng)甲醇量為30%、水相量為70%時(shí)，主峰保留時(shí)間適中，理論板數(shù)為8 612，故確定甲醇與水相比例為30∶70。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下制備的2種溶液適量，另取1份溶劑適量，均按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明供試品主峰與對(duì)照品主峰保留時(shí)間一致，另外空白溶劑對(duì)色譜條件的分離沒(méi)有明顯的影響，3種溶液的色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白溶劑；B.對(duì)照品；C.供試品；1.PTH（1-34）Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank solvent；B.reference substance；C.test sample；1.PTH（1-34）

2.6 線性關(guān)系考察

制備不同濃度 PTH（1-34）溶液：0.06、0.10、0.20、0.40、0.90 mg·mL－1，按“2.10”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄圖譜，以進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，PTH（1-34）峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程得：Y＝1.323×105X－1.115×102（r＝0.999 97），表明PTH（1-34）檢測(cè)濃度的線性范圍為0.06～0.90 mg·mL－1。

2.7 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取樣品適量，加水溶解，制備成0.1 mg·mL－1的溶液，精密吸取20 μL進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜，測(cè)定峰面積。結(jié)果，峰面積RSD＝0.15%，表明精密度良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

分別稱取2 mg質(zhì)量80%、100%、120%的PTH（1-34）原料藥，每種標(biāo)示量各3份樣，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法分別加水溶解并稀釋至相應(yīng)濃度，按含量測(cè)定方法，測(cè)定其回收率。結(jié)果平均回收率為98.6%（RSD＝0.38%），詳見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of recovery test

2.9 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品適量，加水溶解，制備成濃度為0.1 mg·mL－1的溶液，分別于制備后第0、2、4、6、12 h進(jìn)樣分析。結(jié)果，主峰面積積分值的RSD＝0.34%，表明本品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 含量測(cè)定

取供試品適量，加水溶解，制備成濃度為0.1 mg·mL－1的溶液。精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄色譜；另取經(jīng)干燥至恒重的PTH（1-34）對(duì)照品適量，加水溶解，制備成濃度為0.1 mg·mL－1的溶液，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

結(jié)果，3批樣品的標(biāo)示含量分別為98.1%、98.9%和99.2%，均在95.0%～105.0%之間，符合原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，說(shuō)明該色譜分析測(cè)定法可控性好。

3 討論

本試驗(yàn)考察了流動(dòng)相pH值和流動(dòng)相配比對(duì)基線、峰形和理論板數(shù)的影響，結(jié)果表明，流動(dòng)相的pH值為2.5、有機(jī)相為30%、水相量為70%時(shí)，峰形較好，保留時(shí)間適中，主峰理論板數(shù)達(dá)到要求，表明該方法可行。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于甲狀旁腺激素（1-34）原料藥含量的測(cè)定。

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[3]孟 萍.甲狀旁腺激素促進(jìn)骨形成的研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2004，8（3）：540.

[4]韓志巖，彭錦軒.甲狀旁腺激素治療骨質(zhì)疏松研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1997，13（5）：395.

[5]宋彥玉，彭錦軒.甲狀旁腺激素及其受體的藥理學(xué)研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1997，13（6）：481.

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