豬瘟病毒研究進(jìn)展與防控中的幾項(xiàng)實(shí)用技術(shù)

胡 峰，崔玉東，崔尚金

(1.中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室豬傳染病學(xué)研究室，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

豬瘟（swine fever， hog cholera），我國俗稱爛腸瘟，歐洲為了區(qū)別于非洲豬瘟稱其為古典豬瘟（classical swine fever，CSF）。病原是豬瘟病毒（CSFV），屬黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（estivirus） 。豬瘟被國際畜疫會(huì)和歐盟列為須申報(bào)的動(dòng)物傳染病，我國也將其列為一類傳染病。該病于1833年首先發(fā)現(xiàn)于美國的俄亥俄州，自1983年開始暴發(fā)的百余年來，己經(jīng)遍布全世界，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1997年在荷蘭暴發(fā)了CSF，1993年到2000年在德國暴發(fā)，比利時(shí)和意大利20世紀(jì)90年代也相繼暴發(fā)CSF。盡管世界各養(yǎng)豬大國對(duì)CSFV給予了足夠的重視，但是由于參差不齊的疫苗質(zhì)量，不合理的引種、免疫程序以及野豬群也攜帶豬瘟病毒等因素，致使CSF目前仍是威脅各國養(yǎng)豬業(yè)的一個(gè)極重要的傳染病，因此長期以來，豬瘟一直是獸醫(yī)疫病研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。

1 診斷方法

近年來，豬瘟的流行和發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大變化，CSF的發(fā)病早期不表現(xiàn)出所有的癥狀，而且表現(xiàn)的癥狀也越來越不明顯，沒有單一的癥狀能確診CSF。被CSFV感染的豬發(fā)燒出現(xiàn)的敗血癥與沙門氏菌、放線桿菌、嗜血桿菌等引起的敗血癥狀和病變相似，所以也不容易區(qū)分。CSFV與牛病毒性腹瀉病病毒（BVDV）同屬于瘟病毒屬，在結(jié)構(gòu)上、遺傳性以及抗原性上密切相關(guān)，所以與CSFV存在血清學(xué)交叉反應(yīng)，對(duì)豬瘟的診斷造成了干擾。此外，豬瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）的大規(guī)模應(yīng)用，也給CSFV野毒感染豬和疫苗感染豬的血清學(xué)鑒別診斷帶來較大困難，歐盟已經(jīng)禁止使用傳統(tǒng)弱毒疫苗。目前感染CSFV的活豬主要通過對(duì)全血中的病毒或病毒核酸以及血清中抗體的檢測進(jìn)行診斷，對(duì)感染了CSFV的病死豬主要檢測器官中的病毒、病毒核酸以及抗原進(jìn)行診斷。

1.1 病原學(xué)檢測

1.1.1 病毒分離與鑒定

取病變組織（扁桃體、脾臟、淋巴結(jié)等）研磨成乳液，離心、過濾后，接種于PK-15細(xì)胞上培養(yǎng)，其他細(xì)胞系也可以用于病毒分離，但它們至少和PK-15對(duì)CSFV有相同的敏感性。培養(yǎng)24～72 h后可以用免疫熒光抗體試驗(yàn)（FAT）進(jìn)行檢測，也可以在4～5 d后固定，用免疫過氧化物酶染色法檢測。該方法的敏感性比冷凍切片免疫熒光試驗(yàn)的敏感性高，但是速度慢，花費(fèi)較長時(shí)間。

肝素或EDTA處理豬的全血可以用于CSF的早期診斷，該方法比利用血細(xì)胞的某些成分進(jìn)行CSF的早期診斷敏感性高，操作簡便。在－20 ℃條件下冷凍全血樣本，并在37 ℃條件下水浴融化。將血細(xì)胞溶解的血液接種到單層生長的PK-15細(xì)胞上，37 ℃孵育1 h。接種后3～4 d，用PBS洗板，固定，染色，最后用過氧化物酶中和試驗(yàn)檢測。該方法的缺點(diǎn)是在診斷急性CSF時(shí)的敏感性低于傳統(tǒng)的病毒分離方法。

1.1.2 豬瘟兔體免疫交互試驗(yàn)

豬瘟強(qiáng)毒不引起家兔體溫反應(yīng)，但能使其產(chǎn)生免疫力，豬瘟兔化弱毒（HCLV）能使家兔產(chǎn)生定型熱反應(yīng)，但對(duì)已產(chǎn)生免疫力的家兔則不產(chǎn)生體溫反應(yīng)。將病料乳劑接種健康家兔，7 d后用兔化豬瘟弱毒注射家兔，24 h后每6 h測溫1次，連續(xù)3 d。無定型熱反應(yīng)，說明病料中含有豬瘟病毒。

1.1.3 免疫熒光抗體試驗(yàn)（FAT）

FAT是一種快速檢測存在于扁桃體、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)或回腸遠(yuǎn)側(cè)部CSFV抗原的方法。各種組織器官需要來自不同的患病豬，并且在低溫運(yùn)輸過程中不能使用一些防腐劑。將冷凍切片直接用連有異硫氰酸熒光素（FITC）的抗CSF免疫球蛋白染色，然后在熒光顯微鏡下觀察。在感染初期扁桃體最先受到影響，所以扁桃體最適合用此方法檢測?；加衼喖毙院吐訡SF的病豬，F(xiàn)AT檢測回腸常顯陽性，有時(shí)是唯一顯示熒光的部分。這種方法敏感性高、可靠。但是FAT方法對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的操作技能和熒光分析等要求很高，否則會(huì)出現(xiàn)較高的錯(cuò)誤率，通過FAT檢測為陰性的不能完全排除沒有受到CSFV的感染。FAT中使用的抗CSF的免疫球蛋白不能將瘟病毒屬中不同種的抗原區(qū)分開。用于FAT的連接物必須是由來自無特定病原體豬的抗CSFV γ-球蛋白制備的。該方法只能用于新近死亡的動(dòng)物，因?yàn)樽晕胰芙夂图?xì)菌污染都會(huì)造成熒光顯色時(shí)背景著色較深，不易觀察。

1.1.4 雞新城疫病毒強(qiáng)化試驗(yàn)（END）

豬瘟病毒與NDV在豬睪丸細(xì)胞上均不產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE）。在一定條件下，先被CSFV感染的豬睪丸細(xì)胞，隨后再感染NDV時(shí)可產(chǎn)生CPE。這一現(xiàn)象稱為新城疫病毒強(qiáng)化試驗(yàn)（END）。具體方法是在豬睪丸細(xì)胞培養(yǎng)物中接種無菌處理的被檢材料，傳代適應(yīng)之后再接種NDV，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，如果細(xì)胞出現(xiàn)病變，則表示有CSFV存在。Hao Xu等利用這一現(xiàn)象對(duì)CSFV的NS3蛋白進(jìn)行了研究，表明NS3能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.2 血清學(xué)檢測

血清學(xué)檢測通常用于了解豬的群體免疫水平和對(duì)疫苗免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，為預(yù)防接種提供科學(xué)依據(jù)。檢測CSFV的抗體，在提前預(yù)測感染了低毒力CSFV的疑似豬中非常有用。因?yàn)镃SFV具有免疫抑制作用，所以感染后21 d才能確切地檢測到抗體。血清學(xué)調(diào)查的目的就是檢測CSF的殘留，特別是種畜群，同時(shí)還用于CSF撲滅的最后階段的檢測。利用單克隆抗體的病毒中和試驗(yàn)（VN）和ELISA能滿足敏感度的要求。氧化物酶聯(lián)中和試驗(yàn)（NPLA）和免疫抗體中和試驗(yàn)（FAVN）是應(yīng)用最廣泛的技術(shù)， 2個(gè)試驗(yàn)都可在微量滴定板上進(jìn)行。

1.2.1 正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）

抗原與相應(yīng)的抗體在一定條件下結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，但一般肉眼看不見這種復(fù)合物。若將抗原吸附（致敏）在經(jīng)過特殊處理的紅細(xì)胞表面，就能大大提高抗原抗體反應(yīng)的靈敏性。毛文杰等將待檢血清經(jīng)56 ℃ 30 min滅活，在96孔血凝板上將待檢血清、陽性血清和陰性血清用稀釋液作倍比稀釋，各稀釋12孔，隨后加入減半量的豬瘟間接血凝抗原，輕搖振蕩均勻，室溫放置2 h后觀察結(jié)果，來檢測豬的群體免疫水平，該方法操作簡單、重復(fù)性好。

1.2.2 中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)原理是病毒或毒素與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，失去對(duì)易感動(dòng)物的致病力。

熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（VN）。將待檢血清56 ℃ 30 min滅活后做適當(dāng)稀釋，與等體積的200 TCID50/0.1 mL的CSFV中和，然后接入PK-15細(xì)胞，維持液孵育2 d以上。采用直接免疫熒光方法進(jìn)行檢查，并設(shè)立對(duì)照組?？砂l(fā)現(xiàn)對(duì)照組有翠綠色光斑，而試驗(yàn)組光斑消失。其優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng)，操作簡便，但不能定量。

過氧化物酶聯(lián)中和試驗(yàn)（NPLA）。將待檢血清稀釋后與200 TCID50/50 μL的病毒液中和，然后接入細(xì)胞，待細(xì)胞長成單層后固定，加入高免豬抗CSFV血清，最后加入辣根過氧化物酶（HRPO）標(biāo)記的抗豬IgG，作用后加入底物顯色，根據(jù)顏色就可判定結(jié)果。

表面等離子體共振（SPR）試驗(yàn)。基于表面等離子體共振技術(shù)的蛋白芯片可用于檢測抗體滴度，Gomes,P等人利用SPR試驗(yàn)對(duì)14個(gè)農(nóng)場的170份血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明SPR試驗(yàn)具有較高的特異性和敏感度，并且沒有交叉反應(yīng)，與ELISA相比該方法是一種用于CSFV感染后的血清學(xué)診斷和免疫后抗體低度檢測的快速的（總共需要1.5 h）有價(jià)值的工具。目前已經(jīng)利用SPR試驗(yàn)直接對(duì)口蹄疫病毒、疫苗病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、煙草花葉病毒進(jìn)行檢測。

1.2.3 ELISA試驗(yàn)

1.2.3.1 捕獲ELISA方法

為了快速診斷CSF，抗原捕捉ELISAs試驗(yàn)可用于新近疑似感染CSFV的畜群的篩選，ELISAs是一種雙抗體夾層式，利用單克隆抗體或多克隆抗體檢測血清中的病毒蛋白、血細(xì)胞以及血液中的抗凝因子。另外，某些試劑盒還用于純化組織均質(zhì)物。此項(xiàng)技術(shù)操作起來相對(duì)簡單，不需要組織培養(yǎng)設(shè)備，便于自動(dòng)化，只需半天就可出結(jié)果。但缺點(diǎn)是靈敏性比病毒分離方法的低，特別是對(duì)溫和型和臨床癥狀不明顯的病例檢測中靈敏性較低。這一缺點(diǎn)可以通過對(duì)所有的疑似發(fā)熱畜群進(jìn)行檢測來得到補(bǔ)償，然而在檢測中還應(yīng)考慮試驗(yàn)的特異性。該方法不適合單個(gè)患CSF的病例診斷。捕獲ELISA能夠檢測2種不同豬瘟病毒株感染的病豬的血液和組織中的抗體。

1.2.3.2 間接ELISA法

首先包被抗原，將待檢血清稀釋后加入孔中，然后加入標(biāo)記物，最后加入底物顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)判定結(jié)果。Guo-zhen LIN等人利用大腸桿菌表達(dá)CSFV的E2中4個(gè)抗原表位，并作為包被抗原建立間接ELISA，特異性地檢測豬血清樣品中的抗CSFV抗體。結(jié)果表明，與間接血凝試驗(yàn)（IHA）相比，間接ELISA方法的敏感度是97.5%，特異性是96.7%。包被的抗原與抗牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）抗體之間無交叉反應(yīng)。

1.2.4 單克隆抗體技術(shù)

用純化的豬瘟病毒免疫BALB/ c小鼠，取其脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。經(jīng)篩選最終獲得了能穩(wěn)定傳代并分泌抗豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，制備的單克隆抗體與其他抗原無交叉反應(yīng)，能快速做出診斷。用過氧化物酶或異硫氰酸熒光素連接物標(biāo)記的3種單克隆抗體，分別特定性的檢測CSFV野毒株、CSFV疫苗株和反芻動(dòng)物瘟病毒，一方面能準(zhǔn)確的將CSFV野毒株與CSFV疫苗株區(qū)分開，另一方面能將CSFV與其他瘟病毒區(qū)分開。豬感染了CSFV后體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生針對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白Erns和E2以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的抗體，通過針對(duì)NS3的單克隆抗體表明NS3是保守的抗原表位，因此可以利用針對(duì)Erns和E2的單抗來區(qū)分豬瘟病毒屬的不同種和同一種中的不同株。

1.3 分子生物學(xué)方法

1.3.1 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

通過純化感染了CSFV的PK-15細(xì)胞培養(yǎng)液，提取CSFV，設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR擴(kuò)增5'端的非編碼區(qū)和編碼糖蛋白E2基因的目的片段，測序，并與數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行比較，從而做出診斷。該方法是國際上認(rèn)可的用于快速診斷CSF，它的靈敏度高于抗原捕捉ELISAs和病毒分離方法，所以它較適合于臨床診斷。因其診斷的速度和敏感性現(xiàn)在已被歐盟一些國家所接受。但是該方法在操作時(shí)要防止實(shí)驗(yàn)室污染，以免造成假陽性，同時(shí)待檢樣品中含有抑制劑也會(huì)造成假陰性。對(duì)初次暴發(fā)CSF的地區(qū)診斷的陽性結(jié)果都須用其他方法進(jìn)行確診。CSF的分子流行病學(xué)基于不同病毒株的遺傳差異，RT-PCR根據(jù)核酸序列擴(kuò)增CSFV的RAN，這是獲得用于比較的核酸序列數(shù)據(jù)最簡單的方法。

1.3.2 套式PT-PCR

套式PT-PCR是一種基于限制性片段長度多肽性分析而建立起來的診斷方法，用于對(duì)CSFV基因亞型的分類和區(qū)分CSFV疫苗株和野毒株。Ning Chen等人基于對(duì)CSFV蛋白E2基因的限制性片段長度多肽性分析建立了套式PT-PCR，對(duì)來自中國東南部2003年到2008年間的321例臨床樣本進(jìn)行檢測，檢出96例陽性樣本，并對(duì)這96例陽性樣本做進(jìn)一步區(qū)分鑒定，鑒定出23例是感染疫苗株CSFV，62例是野毒株，11例是疫苗株CSFV與野毒株混合感染。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（FQPCR）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（FQPCR）在基因表達(dá)水平的分析、病原體的定性和定量檢測等方面得到了廣泛應(yīng)用。在熒光實(shí)時(shí)PT-PCR技術(shù)中利用了非特異性的SYBR Green I作為染料和特異性的水解熒光探針Taqman（standard rRT-PCR）。Taqman探針是一條線性的寡核苷酸鏈，熒光染料在其5′端，淬火分子在其3′端，與互補(bǔ)DNA雜交后，在延伸過程中被具有5′-3′外切酶活性的Taq聚合酶降解，同時(shí)放出報(bào)告基因的熒光。Risatti等應(yīng)用standard rRT-PCR對(duì)CSFV快速檢測進(jìn)行了研究，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法的敏感性可以達(dá)到甚至超過病毒培養(yǎng)。目前Guoyuan Wen等人利用小溝結(jié)合探針（MGB）建立了MGB實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)(MGB rRT-PCR)，MGB部位可以使探針更加牢固的結(jié)合到單鏈DNA上，因此在反應(yīng)中可以提高解鏈溫度，從而可以設(shè)計(jì)更短的特異性強(qiáng)的探針。結(jié)果表明，MGB rRTPCR技術(shù)的敏感度比standard rRTPCR技術(shù)和病毒分離方法高出10倍。檢測261份現(xiàn)場樣品，MGB rRT-PCR技術(shù)與standard rRT-PCR技術(shù)和病毒分離的檢測結(jié)果一致性分別是93.3%和76.7%。Zhao JJ等人建立了多重實(shí)時(shí)RT-PCR，可定量的區(qū)分CSFV野毒株和疫苗株。

1.3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)

LAMP是一種新型的，快速的，敏感性高的診斷技術(shù)，由日本的Notomi等人創(chuàng)建。RT-LAMP是在恒溫條件下進(jìn)行的，不需要額外的加熱設(shè)備，只需要一個(gè)水槽和熱帶就能完成擴(kuò)增，只需一個(gè)管將所有反應(yīng)物混合在一起，63 ℃ 1 h。效率高，可以對(duì)大量的樣品進(jìn)行檢測。基于此目前LAMP已廣泛用于病毒診斷。針對(duì)CSFV編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)6條引物（2條外引物，2條內(nèi)引物，2條環(huán)引物），倍比稀釋病毒。靈敏度試驗(yàn)表明比RT-PCR高100倍，能檢測到10-6稀釋的103.84TCID50的CSFV。LAMP檢測出13株CSFV，同時(shí)與其他非CSFV進(jìn)行交叉反應(yīng)，結(jié)果都是陰性。

1.3.5 PCR-ELISA

PCR-ELISA 是用免疫學(xué)方法檢測PCR產(chǎn)物，即在PCR擴(kuò)增后，在微量板上借用ELISA的原理，使用酶標(biāo)抗體，進(jìn)行固相雜交來實(shí)現(xiàn)定量。其原理是在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)一個(gè)引物的5′端標(biāo)記生物素，另一引物則在5′端標(biāo)記顯色基團(tuán)（如FITC，用HRP標(biāo)記的抗FITC結(jié)合顯色），這樣PCR產(chǎn)物就可結(jié)合到親和素包被的塑料板上，靶序列被捕獲。再在微孔中加入用HRP標(biāo)記的抗體，抗體與靶序列上的抗原結(jié)合，再加入底物使之顯色，可進(jìn)行常規(guī)ELISA檢測，設(shè)計(jì)已知標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可進(jìn)行定量。該方法的敏感性可與放射性核素標(biāo)記相比，但又避免了核素的危險(xiǎn)。

1.4 免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合。因此膠體金技術(shù)廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)等領(lǐng)域。顧建等人用免疫膠體金技術(shù)對(duì)20份血清進(jìn)行檢測，同時(shí)采用ELISA方法同比檢測作對(duì)比，免疫膠體金技術(shù)檢出陽性率是75%，ELISA方法檢出率是90%。雖然免疫膠體金技術(shù)敏感度低，但具有簡便、快速、并可單份操作的優(yōu)點(diǎn)，步驟單一，實(shí)驗(yàn)過程時(shí)間20 min左右，無須儀器協(xié)助，且標(biāo)本不易污染，適用于緊急檢測。

1.5 基因芯片技術(shù)

基因芯片是近年來分子生物學(xué)與微電子學(xué)等多學(xué)科交叉融合而成的一項(xiàng)高新技術(shù)，指在一個(gè)很小的表面，通常是硅化玻璃，覆蓋有成千上萬的寡核苷酸，每一個(gè)固定在芯片上的特定位置，可以找到這個(gè)點(diǎn)，每個(gè)寡核苷酸反應(yīng)芯片上成千上萬拷貝互補(bǔ)信息。包括cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因組芯片。楊林采用基因測序?yàn)榛A(chǔ)的系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析方法，對(duì)黑龍江部分地區(qū)豬瘟病毒流行株進(jìn)行分離鑒定和E2基因序列分析，并與傳統(tǒng)石門強(qiáng)毒和豬瘟兔化弱毒苗在抗原基因上存在的變異進(jìn)行了比較，結(jié)果表明：所檢測的病料是CSFV感染、CSF流行毒株和疫苗株在核苷酸和氨基酸序列上存在一定差異，E2基因部分序列接近CSFV的Alfort株，與Brescia同源性最低。姜永厚等人究建立了一種基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片檢測和區(qū)分豬瘟病毒(CSFV)，豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的方法，對(duì)76個(gè)仔豬樣本進(jìn)行了檢測，檢出了3種病毒的存在，其中25個(gè)樣本32.9 %同時(shí)感染了2種以上病毒。結(jié)果表明寡核苷酸基因芯片檢測是一種快速、靈敏和高效的豬只混合感染病毒的病原學(xué)診斷方法。

2 疫苗研究進(jìn)展

2.1 傳統(tǒng)疫苗

自1903年De Sehweinitz和Dorset首次證明CSFV是一種濾過性病毒以來，人們采用各種免疫方法預(yù)防和控制豬瘟。最初應(yīng)用的是高免血清，但由于高免血清昂貴，獲取困難，加之血清有散毒的危險(xiǎn)，因此高免血清的使用受到限制。后來出現(xiàn)許多滅活疫苗，其中福爾馬林和結(jié)晶紫滅活苗曾被廣泛應(yīng)用。滅活疫苗雖然安全，但保存期短。所以人們開始研制弱毒活疫苗，其中應(yīng)用較廣的是中國的兔化弱毒疫苗株，日本的細(xì)胞弱毒疫苗GPE-株，法國的Thiverval株，這些弱毒疫苗在豬瘟控制中起著重要作用。但是，使用弱毒活疫苗免疫的豬群，在流行病學(xué)調(diào)查和豬瘟防治工作中，不能用血清學(xué)方法來區(qū)分自然感染豬群和免疫接種豬群，另外，弱毒活苗還有可能與野毒重組或進(jìn)行自然突變而造成毒力返強(qiáng)，出現(xiàn)免疫耐受現(xiàn)象。目前歐盟一些國家已禁止使用傳統(tǒng)疫苗，隨著對(duì)CSFV分子水平研究的不斷深人和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，基因工程亞單位疫苗和DNA疫苗成為研究的熱點(diǎn)。

2.2 基因工程亞單位疫苗

CSFV中具有免疫原性，能產(chǎn)生中和抗體的蛋白是E0和E2，糖蛋白E2是CSFV免疫原性最好的蛋白，基于E2的亞單位疫苗具有保護(hù)性并能產(chǎn)生高滴度的中和抗體?？梢岳谜婧思?xì)胞高效表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)豬瘟病毒免疫原蛋白，并以此表達(dá)產(chǎn)物為抗原制造疫苗。桿狀病毒（Baculovirus）-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)可高水平表達(dá)外源蛋白，昆蟲細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的加工和運(yùn)轉(zhuǎn)過程與哺乳動(dòng)物類似，所表達(dá)的蛋白“仿真”程度較高。Hulst等將豬瘟病毒E2基因cDNA重組入核型多角體病毒，并在sf21細(xì)胞中表達(dá)，用20～100 μg的表達(dá)蛋白免疫豬，可抵抗100 LD50的豬瘟強(qiáng)毒攻擊，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體水平遠(yuǎn)高于由弱毒疫苗免疫產(chǎn)生的水平。目前由于該疫苗生產(chǎn)技術(shù)具有安全、穩(wěn)定、可規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn)，同時(shí)又可根據(jù)流行毒株的變化，更換合適的E2 基因，因此，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.3 病毒活載體疫苗

以無致病力或低毒力的痘苗病毒（VAC）和偽狂犬病病毒（PRV）為載體，將豬瘟病毒E2基因與之重組研制出的基因重組疫苗，免疫動(dòng)物后可對(duì)2種病毒產(chǎn)生良好的保護(hù)力。對(duì)此類疫苗的安全性和實(shí)用價(jià)值目前還有爭議，一旦將該病毒放入自然界中，將有可能衍變出對(duì)人、獸有危害的病毒變種。另一方面，偽狂犬病是較為普遍的一種疾病，豬瘟—偽狂犬病重組疫苗對(duì)于已感染或已免疫的動(dòng)物不能產(chǎn)生保護(hù)力。Moormann等（1996）拼接出以C2株感染性全長cDNA，用強(qiáng)毒E2基因取代原有E2基因，構(gòu)建出了豬瘟雜交病毒。Van Zijl等人將CSFV的E2蛋白基因重組到狂犬病病毒中，并進(jìn)行高效表達(dá)，然后免疫豬，效果明顯。

2.4 標(biāo)記疫苗

該疫苗就是對(duì)豬瘟兔化弱毒進(jìn)行改造，使其缺失某一段基因或某一段特殊片段，但其免疫原性不改變。以缺失的基因所表達(dá)的蛋白作為診斷抗原，能夠區(qū)別疫苗接種豬和自然感染豬產(chǎn)生的抗體。便于及早發(fā)現(xiàn)感染動(dòng)物，采取控制措施，可為在實(shí)施豬瘟“撲滅計(jì)劃”時(shí)減少大量錯(cuò)殺導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。De Smit等人將C株進(jìn)行重組克隆出了新的重組疫苗株。G R Risatti等研究了E2亞單位標(biāo)記疫苗在實(shí)驗(yàn)條件下的免疫保護(hù)情況并發(fā)現(xiàn)E2亞單位標(biāo)記疫苗免疫效果明顯。

2.5 DNA疫苗

DNA 疫苗是近年發(fā)現(xiàn)并形成的一種新的疫苗研制技術(shù)，以配有原核復(fù)制元件和真核表達(dá)調(diào)控元件的質(zhì)粒為載體，將豬瘟病毒主要保護(hù)性抗原基因插入該質(zhì)粒中，使病毒核酸在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)。Hammmond等用表達(dá)CSFV E2基因的裸露質(zhì)粒DNA免疫6周齡斷奶仔豬和7日齡提前斷奶乳豬，再將這2組豬群均用表達(dá)E2基因的腺病毒重組體（rPAV-gp55）加強(qiáng)免疫一次，用CSFV攻毒后，100%的仔豬和75%的乳豬獲得保護(hù)。但同時(shí)還應(yīng)考慮核酸疫苗存在的安全性問題，Markowska Daniel等報(bào)道CSFV DNA 疫苗免疫豬后短時(shí)內(nèi)體溫可高達(dá)40 ℃以上，對(duì)豬體有一定的影響。由于該重組子可通過發(fā)酵培養(yǎng)方式大量制備，又具有相對(duì)較好的穩(wěn)定性，并且大容量的質(zhì)粒還可同時(shí)容納多種病毒的免疫原基因，因此，這項(xiàng)制苗技術(shù)具有很大的研究價(jià)值。

3 防控中的幾項(xiàng)實(shí)用技術(shù)

3.1 確定疫苗含量、并能和野毒感染進(jìn)行鑒別的實(shí)用技術(shù)

主要包括RT-PCR（套式PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)），膠體金等。

我國采用免疫豬瘟兔化弱毒疫苗很好地預(yù)防和控制了豬瘟在我國的大規(guī)模流行，疫苗含量是保證疫苗有效的關(guān)鍵因素。RT-PCR（套式PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)），膠體金等可以進(jìn)行此類工作。可以使基層獸醫(yī)在疫情暴發(fā)時(shí)在現(xiàn)場確診，及早采取措施控制疾病的流行。根據(jù)CSFV野毒和弱毒核酸序列差異建立的套式PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，能區(qū)分CSFV野毒和弱毒，主要用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，不適合現(xiàn)場檢測，臨床迫切需要一種能區(qū)分野毒和疫苗毒方法的出現(xiàn)，2006年出現(xiàn)了利用MGB探針建立了區(qū)分韓國5KLOM疫苗株和野毒株的方法；2008年國內(nèi)有學(xué)者也建立了能區(qū)分HCLV疫苗株和野毒株的多重RT-PCR方法和FQ-PCR方法，前者由PCR后處理，易污染；后者雖不需后處理，但與前者一樣，分2步進(jìn)行，費(fèi)時(shí)。

膠體金免疫層析技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新型體外診斷技術(shù)。該診斷方法快速簡便，操作簡單，無需儀器，結(jié)果準(zhǔn)確。其基本原理是利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細(xì)層析作用，使抗原抗體在固相膜上反應(yīng)，然后用膠體金標(biāo)記的抗體顯色，陽性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色，陰性反應(yīng)則不出現(xiàn)紅色。已經(jīng)報(bào)道的豬瘟膠體金診斷技術(shù)，主要基于豬瘟病毒抗體定量檢測和病原定性檢測，對(duì)豬感染CSFV野毒或接種免疫弱毒疫苗不能進(jìn)行鑒別診斷。哈獸研利用了能區(qū)分CSFV野毒和兔化弱毒的單克隆抗體，結(jié)合膠體金免疫層析技術(shù)，研制了能鑒別診斷CSFV野毒和兔化弱毒的膠體金免疫層析試紙條。

3.2 鑒別豬瘟病毒、牛腹瀉病毒的實(shí)用技術(shù)

豬瘟病毒、牛腹瀉病毒是同一類的病毒，它們感染癥狀相似，而且牛腹瀉病毒引起的抗體會(huì)混淆、誤導(dǎo)豬瘟的免疫，并且這些年來我們國家有些廠家的疫苗并不合格，主要是含有牛腹瀉病毒。因此以牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）特異引物P1/P3擴(kuò)增BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株及以豬瘟病毒（HCV）特異引物P2/P3擴(kuò)增HCV陽性病料，分別擴(kuò)增出326 bp和252 bp的特異片段；以P1、P2、P3擴(kuò)增BVDV和HCV人工混合感染樣品，擴(kuò)增出大小為326 bp和252 bp的2條片段，建立特異的一步檢測BVDV和HCV的復(fù)合PCR方法。以建立的復(fù)合PCR方法檢測BVDV分離株，都擴(kuò)增出1條326 bp的特異片段；從送檢的病料和豬瘟兔化弱毒疫苗中擴(kuò)增出252 bp的特異片段，從疑似豬瘟病豬的血清病料中，同時(shí)擴(kuò)增出326 bp和252 bp的核酸片段，表明某豬場流行的“豬瘟”為BVDV和HCV混合感染。為進(jìn)行HCV和BVDV的鑒別診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的方法，特別是為鑒定合格的疫苗提供了技術(shù)手段。

3.3 快速確診豬瘟病毒以及簡單測定豬瘟抗體的的實(shí)用技術(shù)

可以使基層獸醫(yī)在疫情暴發(fā)時(shí)在現(xiàn)場確診，及早采取措施控制疾病的流行。如果能夠在免疫以后能夠隨時(shí)確定抗體，在平時(shí)可以進(jìn)行抗體追蹤和隨時(shí)監(jiān)測，那將是十分方便的。正如剛才介紹的，膠體金可以實(shí)現(xiàn)這2個(gè)愿望。

3.3.1 當(dāng)母豬分娩時(shí)，用抗體免疫金標(biāo)試紙條檢測母豬的抗體水平

如果在試紙條上只出現(xiàn)1條色帶（C質(zhì)控帶），說明母豬體內(nèi)的抗體滴度低于抵抗強(qiáng)毒攻擊的最低保護(hù)抗體滴度，母豬應(yīng)當(dāng)及時(shí)進(jìn)行疫苗接種，同時(shí)乳豬應(yīng)當(dāng)及時(shí)采用超前免疫，以免發(fā)生PRRS病。如果試紙條上出現(xiàn)2條色帶，說明體內(nèi)的抗體滴度較高，可以抵抗強(qiáng)毒的攻擊，就不需要進(jìn)行超前免疫，因?yàn)槟肛i可以通過初乳把抗體垂直帶給仔豬。這時(shí)仔豬可以按照正常的免疫程序進(jìn)行預(yù)防注射。

3.3.2 外購豬時(shí)，可用抗體免疫金標(biāo)試紙條檢測其是否免疫或免疫是否有效

為了防止CSFV發(fā)生，選擇什么時(shí)間再進(jìn)行CSFV免疫最合適，則可以根據(jù)不同地區(qū)，不同日齡的豬只，選擇有代表性的豬只采血，應(yīng)用豬CSFV抗體免疫金標(biāo)試紙條進(jìn)行快速檢測，通過檢測結(jié)果，可以了解整個(gè)豬群PRRS抗體的狀況，從而決定是否及時(shí)開展免疫及選擇適宜的免疫劑量，這樣可以大大地避免PRRS的發(fā)生。

3.3.3 在懷疑發(fā)生CSFV時(shí)使用，可以采集病豬血液（血清）

用CSFV金標(biāo)檢測試紙檢測，如果是發(fā)生CSFV時(shí)，豬體血液中沒有CSFV抗體或抗體滴度很低。當(dāng)然，發(fā)生CSFV而耐過不死的豬只，抗體滴度可能會(huì)很高。

3.3.4 在發(fā)生CSFV后使用

當(dāng)發(fā)生CSFV時(shí)，常規(guī)的處理程序是全面隔離消毒和緊急預(yù)防注射。此時(shí)豬群特別是種豬場的豬群抗體滴度差異很大，當(dāng)緊急預(yù)防注射后，抗體滴度又會(huì)出現(xiàn)明顯的差異，因此，還應(yīng)當(dāng)了解豬群CSFV抗體水平，制定合理的免疫程序尤為重要。

4 問題與展望

迄今為止，人們對(duì)CSFV的研究始終沒有停止過，CSFV的結(jié)構(gòu)蛋白已經(jīng)定位，但對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白的定位、功能等研究還較少。對(duì)本病診斷方法的研究，由于近幾年CSF的流行情況、臨床癥狀等都發(fā)生了一些新的變化，以慢性、隱性感染為主，因此需要建立一種敏感性好、特異性強(qiáng)、快速方便的檢測方法。許多的研究表明，該病毒與細(xì)小病毒和大腸桿菌病等同時(shí)發(fā)生混合感染在豬群中已經(jīng)相當(dāng)?shù)钠毡?，要想根除本病，需要制定更為科學(xué)的防治方法?，F(xiàn)在雖然很少發(fā)生CSF大流行，但在某些地區(qū)小范圍內(nèi)還會(huì)經(jīng)常發(fā)生，而且近幾年有上升的趨勢(shì)，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國作為一個(gè)養(yǎng)豬大國，時(shí)刻不能放松對(duì)CSF的研究，特別是國內(nèi)關(guān)于分子生物學(xué)和基因工程方面的研究，這不僅對(duì)養(yǎng)豬業(yè)是嚴(yán)峻的考驗(yàn)，也給獸醫(yī)科技工作者提出了緊迫和重大的課題。