生存素在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌及鱗狀細胞癌組織中的表達①

劉 梅 趙 琰 肖 汀 王雅坤 金光玉 陳洪鐸 何春滌

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科衛(wèi)生部免疫皮膚病學重點實驗室,沈陽110001)

瘢痕形成是創(chuàng)傷修復的必然結(jié)果,但過度修復會引起成纖維細胞功能的異常,導致瘢痕疙瘩的形成。瘢痕組織可以發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變而成為皮膚瘢痕癌(Skin scar carcinoma,SSC),癌變組織病理學以鱗狀細胞癌(簡稱鱗癌,Squamous cell carcinoma,SCC)最多見[1]。皮膚鱗癌是最常見的皮膚惡性腫瘤之一,其發(fā)病率約占全部非黑素性皮膚惡性腫瘤的20%[2]。皮膚鱗癌侵襲性和轉(zhuǎn)移能力強,臨床危害大[3]。生存素基因是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因,是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的成員,它能促進腫瘤細胞增殖、血管生成并抑制細胞凋亡[4]。目前許多研究表明,生存素基因的表達是癌變發(fā)生的早期事件,且與腫瘤的演進、預后、復發(fā)及患者的存活率有一定關(guān)系[5-7]。因而,針對生存素基因的靶向治療成為近年的研究熱點。我們采用免疫組化方法檢測生存素在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌及鱗癌組織中表達情況,并對其臨床病理意義進行探討。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 病例與標本 所有石蠟標本均為中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科1981～2008年間手術(shù)切除經(jīng)HE染色確診標本,其中瘢痕疙瘩41例,皮膚瘢痕癌35例,鱗癌46例。35例皮膚瘢痕癌標本經(jīng)組織病理證實均為鱗癌。所有病例活檢術(shù)前均未放射治療或化療。另以10例正常皮膚組織為對照。根據(jù)未分化癌細胞所占的百分比和細胞非典型性的程度,即Broders提出的分級法,將鱗癌病理分為4級。Ⅰ級:瘤團侵入深度不超過汗腺水平,瘤團周圍基底層部分完整,部分則排列紊亂或消失,與周圍基質(zhì)分界不清。分化良好的鱗狀細胞占75%以上,大多數(shù)細胞間橋發(fā)育良好,角珠數(shù)量多,真皮炎癥反應明顯。Ⅱ級:瘤團一般與周圍基質(zhì)界限不清,分化良好的鱗狀細胞占50%以上,僅有少量角珠,有相當多而異形細胞。Ⅲ級:瘤團與周圍間質(zhì)分界不清,分化良好的鱗狀細胞占25%以上,許多部位角化現(xiàn)象消失,不見角珠。大多數(shù)腫瘤細胞核呈非典型性,核分裂像明顯。Ⅳ級:瘤團中正常鱗狀細胞少于25%,絕大多數(shù)為異形,角化現(xiàn)象幾乎完全缺乏,無細胞間橋。在皮膚瘢痕癌中,Ⅰ級18例,Ⅱ級13例,Ⅲ級4例;男性19例,女性16例;年齡39～80歲,平均(59.31±9.75)歲,其中≥50歲28例;原發(fā)病為燒傷17例,尋常狼瘡14例,外傷4例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例。在皮膚鱗癌中,Ⅰ級16例,Ⅱ級21例,Ⅲ級9例;男性25例,女性21例;年齡35～79歲,平均(55.67±13.82)歲,其中≥50歲34例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。在瘢痕疙瘩中,男性26例,女性15例;年齡 22～64歲,平均(37.43±18.64)歲,其中≥50歲16例。

1.1.2 主要試劑 生存素單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。SP試劑盒、二胺基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自福建邁新生物技術(shù)公司。

1.2 方法 免疫組化采用鏈霉親和素過氧化酶(SP)法,抗原修復采用微波修復法,生存素抗體稀釋度為1∶100。石蠟切片脫蠟和水化后,采用微波抗原修復,先后滴加過氧化酶阻斷劑(試劑1),正常非免疫動物血清(試劑2),一抗(生存素),生物素標記的二抗(試劑3),抗生物素蛋白-過氧化酶溶液(試劑4),室溫下孵育10分鐘。PBS沖洗3次,每次3分鐘。DAB顯色,自來水沖洗,蘇木素復染,自來水沖洗返藍,梯度酒精脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封固。

1.3 結(jié)果判定 在光學顯微鏡下觀察并計數(shù)。陽性結(jié)果以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。低倍鏡下選取染色最均勻的區(qū)域,高倍鏡下計數(shù),每張切片任意選5個不同的高倍視野(×400),每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞中陽性細胞數(shù),取其平均數(shù)求陽性率。采用Sinicrope改良法(半定量積分法)[8]。先根據(jù)染色深淺計分:1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)深棕色斑塊。再按陽性細胞所占百分比計分:0分＜5%,1分5%～25%,2分26%～50%,3分51%～75%,4分＞75%。二者相乘即為該片的積分,積分≤1記為陰性,＞1記為陽性。所有染色切片均由2名病理學工作者盲法判定。

1.4 統(tǒng)計分析 應用SAS 8.2軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。采用率或構(gòu)成比描述分類資料;不同組間率或構(gòu)成比比較采用 χ2檢驗或Fisher檢驗,P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 生存素蛋白在皮膚瘢痕癌、鱗癌、瘢痕疙瘩及正常皮膚中的表達 生存素在皮膚瘢痕癌、鱗癌、瘢痕疙瘩皮損中均呈陽性表達,胞漿均呈現(xiàn)黃色或棕黃色,而胞核不著色;正常皮膚組織中未見生存素蛋白表達(圖1A-D)。

按陽性標準判斷,在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌、鱗癌中,生存素蛋白的表達陽性率分別為31.71%(13/41)、54.29%(19/35)、60.87%(28/46)。兩兩之間進行比較,皮膚瘢痕癌與鱗癌的生存素蛋白表達陽性率均高于瘢痕疙瘩(P值均＜0.05),而皮膚瘢痕癌與鱗癌之間生存素蛋白表達差異無顯著性(P＞0.05)。

圖1 生存素在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌、鱗癌及正常對照皮膚中免疫組化結(jié)果Fig.1 Immunohistochemistry of survivin in keloid,skin scar carcinoma,squaumous cell carcinoma lesions and normal control skins

表1 生存素在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌、皮膚鱗癌中的表達與性別、年齡、原發(fā)病、臨床病理特征及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系Tab.1 Correlation analysis between gender,age,primary diseases,clinical pathological staging,lymph node metastasis and survivin expression in keloid,skin scar carcinoma,squaumous cell carcinoma lesions

2.2 生存素蛋白在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌、皮膚鱗癌中的表達與性別、年齡、原發(fā)病及臨床病理特征的關(guān)系 生存素蛋白在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌、鱗癌中的表達與性別、年齡均無關(guān);生存素蛋白在皮膚瘢痕癌中的表達與原發(fā)病無關(guān);生存素蛋白在皮膚瘢痕癌與皮膚鱗癌中的表達與組織病理分級無明顯關(guān)系,與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(表1)。

3 討論

細胞的凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、臨床治療有密切的關(guān)系,是腫瘤生長的重要調(diào)節(jié)因素之一[9]。生存素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子,抑制細胞的程序化死亡,導致細胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。生存素在胚胎發(fā)育期間表達,終末分化組織中不表達,但在很多的轉(zhuǎn)化細胞系和腫瘤組織中高表達,在癌旁組織中不表達。生存素抗細胞凋亡作用的可能機制有:(1)通過與凋亡蛋白酶終末分子caspase-3和caspase-7結(jié)合,從而發(fā)揮抗凋亡作用;(2)其螺旋結(jié)構(gòu)與有絲分裂微管結(jié)合,通過抑制caspase-9導致抑制caspase系統(tǒng),從而抑制caspase引起的細胞凋亡;(3)通過與細胞周期調(diào)節(jié)因子CDK4形成復合體,使p21從CDK4復合體中釋放并與線粒體中的procaspase-3結(jié)合,從而抑制Fas介導的細胞凋亡[10-12]。

本免疫組化實驗顯示,生存素在正常皮膚組織中不表達;生存素在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌及鱗癌中表達均較高,表達陽性率分別為31.71%、54.29%、60.87%;皮膚瘢痕癌與鱗癌的生存素蛋白表達陽性率均高于瘢痕疙瘩(P值均＜0.05),而皮膚瘢痕癌與鱗癌之間生存素蛋白表達差異無顯著性(P＞0.05)。上述結(jié)果表明,正常皮膚損傷后,成纖維細胞在創(chuàng)面修復過程中不僅發(fā)生量的變化,更重要的是發(fā)生了質(zhì)的變化—生存素的高表達,過度表達的生存素導致成纖維細胞的凋亡機制存在異常,這可能與瘢痕疙瘩持續(xù)生長、易侵襲、復發(fā)及導致瘢痕癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。生存素的高表達亦可能是皮膚瘢痕癌及鱗癌發(fā)生的重要因素之一。

本研究發(fā)現(xiàn),生存素蛋白在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌、鱗癌中的表達與性別、年齡均無關(guān);生存素蛋白在皮膚瘢痕癌中的表達與原發(fā)病無關(guān);生存素蛋白在皮膚瘢痕癌及皮膚鱗癌中的表達與組織病理分級無關(guān),與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān);皮膚瘢痕癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組生存素陽性率分別為78.6%、38.1%;皮膚鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組生存素陽性率分別為84.2%、44.4%;二者差異均具有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.05),表明生存素的表達可能與皮膚瘢痕癌及皮膚鱗癌的某些生物學特性有關(guān),如發(fā)生局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移等腫瘤的惡性行為[13]。

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