Cyr61對外周血NK細胞的增殖和活性調(diào)節(jié)①

趙俊麗 李鵬飛 郭 葳 郝 莎 胡雅莉 侯亞義

(南京大學醫(yī)學院免疫與生殖生物學實驗室,南京210093)

人外周血自然殺傷(peripheral blood Natutal Killer,pNK)細胞主要分為兩個亞群:占95%的有顆粒和細胞毒性的CD56dimCD16+和占5%的主要以分泌細胞因子發(fā)揮調(diào)節(jié)性作用的CD56brightCD16-[1,2]。NK細胞依賴于細胞膜上抑制性和活化性受體對靶細胞的識別并傳遞細胞信號的平衡來介導細胞毒性和細胞因子的產(chǎn)生。這些信號由各個受體通過識別靶細胞上的MHCⅠ類分子和其它的靶細胞配體進行傳導[3]。NK細胞表面有表達識別多態(tài)性MHCⅠ類的殺傷細胞抑制性受體(KIRs)多基因家族成員。KIR2DL1(2個胞外決定簇)與HLA-C相互作用,而KIR3DL1(3個胞外決定簇)與含有Bw4表位的HLA-B識別?；罨允荏wNKp30、NKp44和NKp46不是通過MHC分子而可能是病毒產(chǎn)物與靶細胞配體進行識別而引發(fā)細胞毒性的[4]。NKp30和NKp46在靜息的NK細胞和活化的NK細胞上都有表達,但NKp44只表達在活化的細胞上[5-8]。大多數(shù)NK細胞組成型表達的活化性受體NKG2D,可以由細胞因子誘導表達,并能夠對受壓力誘導表達的MHC相關的MICA/B或其他的病毒相關產(chǎn)物的靶細胞啟動細胞毒性[9]。CD244可能是活化或共刺激分子的功能。研究發(fā)現(xiàn)外周NK細胞分泌多種細胞因子,但主要分泌IFN-γ[10,11]。

富含半胱氨酸61(Cysteine rich 61,Cyr61)是分泌性肝素連接蛋白,其編碼蛋白具有明顯的促有絲分裂原性和趨化性,能刺激細胞增殖等過程[12]。近年來關于Cyr61在胎盤的表達和定位以及在子癇前期中的異常表達方面也有許多報道。Gellhaus等[13]研究發(fā)現(xiàn)子癇前期患者與同期對照相比在胎盤和外周血清中的Cyr61都顯著下降。胎盤基因芯片結果發(fā)現(xiàn)重度妊高征患者與同期正常對照相比Cyr61表達下降[14]。但是目前關于Cyr61分子是否對外周血NK細胞的增殖和活性功能方面具有調(diào)節(jié)作用還不清楚。

本實驗通過體外實驗采用Cyr61對pNK細胞進行處理,研究Cyr61對pNK細胞在細胞增殖、亞群分化、受體表達、細胞因子IFN-γ的生成和細胞毒性方面的作用。對探討正常妊娠和子癇前期中的Cyr61對免疫細胞的影響奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(HyClone);NK細胞分離試劑盒(NK Cell Isolate Kit)、LD分離柱和MACS磁珠分離器(Miltenyi Biotec);人淋巴細胞分離液(天津灝洋);佛波脂(PMA)和離子霉素(Ionomycin)(Alexis);莫能霉素(e-Bioscience);重組人 IL-12、IL-15 和 Cyr61(Perprotec);皂苷(Sigma);流式細胞儀檢測使用的人單克隆抗體如下:異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的抗CD56、藻紅蛋白(Phecoerythrin,PE)標記的 KIR2DL1、NKp30、NKp46、CD244、PerCP-Cy5.5標記的抗CD3、別藻青蛋白(Allophycocyanin,APC)標記的抗IFN-γ和抗CD16單抗(eBioscience),PE標記的抗NKG2D單抗(Invitrogen);PE標記的抗NKp44和KIR3DL1單抗(Biolegend);同種型對照單抗(BD Pharmingen);流式細胞儀(BD);高壓滅菌鍋(TOMY);超凈臺(Baker);CO2培養(yǎng)箱(Heraeus);Labofuge400R冷凍離心機(Heraeus);倒置熒光顯微鏡(Nikon)

1.1.2 細胞 未妊娠婦女的EDTA抗凝外周血由江蘇省血液中心提供;K562細胞購于中國科學院上海細胞所。

1.2 方法

1.2.1 外周血淋巴細胞的分離 根據(jù)人淋巴細胞分離液說明書操作得到外周血單個核細胞(PBMC),然后用RPMI1640培養(yǎng)基和10%FBS重懸細胞,將PBMC鋪在培養(yǎng)板中,于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃靜置培養(yǎng)2小時使單核細胞貼壁,然后收集未貼壁的外周血淋巴細胞(Peripheral blood lymphocytes,PBL)。

1.2.2 外周血NK細胞的磁珠分選和純度鑒定將上述得到的淋巴細胞進行計數(shù),加入磁珠專用PBS緩沖液重懸,按照NK Cell Isolate Kit說明書步驟進行磁珠陰選,收集LD柱流出的細胞即NK細胞;用抗人的PerCP-Cy5.5標記的CD3和FITC標記的CD56單抗進行染色,流式細胞儀檢測FL1/FL3通道細胞,收集總的10 000細胞,最后用CellQuestTM軟件分析pNK細胞的純度。

1.2.3 Cyr61對淋巴細胞處理和NK細胞的增殖和亞群分析 將分離得到的外周血淋巴細胞鋪于48孔培養(yǎng)板(每孔2×105個細胞);用100 U/ml重組人IL-2、100 U/ml重組人IL-15和100 ng/ml重組人Cyr61對淋巴細胞進行處理(設不處理組為對照組),在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中處理24小時;收集細胞,PBS洗滌,用抗人的 PerCP-Cy5.5標記的 CD3、FITC標記的CD56和APC標記的CD16單抗進行直接標記染色,4℃避光孵育30分鐘;PBS洗滌2次后,上流式細胞儀檢測,收集總的10 000細胞;CellQuestTM軟件分析淋巴細胞的CD3-CD56+NK細胞的百分數(shù)和CD3-CD56+CD16+和CD3-CD56+CD16-NK細胞亞群。

1.2.4 NK細胞表面受體的檢測 將分離得到的外周血淋巴細胞和磁珠純化NK細胞鋪于48孔培養(yǎng)板(每孔2×105個細胞),用 100 U/ml IL-2單獨處理作為對照組,100 U/ml IL-2聯(lián)合100 ng/ml Cyr61作為處理組。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中處理48小時;收集細胞,PBS洗滌;淋巴細胞用抗人的PerCPCy5.5標記的CD3和FITC標記的CD56分別與PE標記的 KIR2DL1 、KIR3DL1、NKG2D 、NKp30 、NKp44和CD244等單抗進行直接三色細胞熒光標記染色,4℃避光孵育30分鐘;PBS洗滌2次,1 500 r/min,5分鐘離心。采用流式細胞儀檢測FL1/FL3通道的CD3-CD56+NK細胞的基礎上,然后檢測FL1/FL2通道的細胞,最后用CellQuestTM軟件分析NK細胞各受體在NK細胞陽性表達的百分比。每個處理組設三個重復孔。至少進行三次獨立實驗。純化pNK細胞直接用 PE標記的抗人的KIR2DL1、KIR3DL1、NKG2D、NKp46和CD244抗體直接標記染色,4℃避光孵育30分鐘;流式細胞儀檢測FL2通道總的10 000細胞,CellQuestTM軟件分析NK細胞各受體的陽性表達率。

1.2.5 NK細胞胞內(nèi)細胞因子IFN-γ的檢測 將磁珠純化得到的NK細胞鋪于48孔板培養(yǎng)板(每孔2×105個細胞),用100 U/ml IL-2單獨處理作為對照組,100 U/ml IL-2聯(lián)合100 ng/ml Cyr61處理作為處理組。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)處理24小時和48小時;在處理結束前的5小時用50 ng/ml的PMA和1μg/ml的Ionomycin刺激NK細胞,1小時后加入莫能霉素(終濃度為1.7μmol/L)。PBS洗滌1次,用500μl 4%多聚甲醛室溫固定細胞20分鐘;1 500 r/min,5分鐘離心,然后用1 ml含0.1%皂苷的PBS打孔孵育細胞15分鐘;離心5分鐘后,用別藻青蛋白(Allophycocyanin,APC)標記的抗人IFN-γ單抗進行標記染色,4℃避光孵育30分鐘后,用含0.1%皂苷的PBS洗滌2次,上機檢測,收集FL4通道的10 000細胞;CellQuestTM軟件分析進行 IFN-γ+百分率分析。

1.2.6 細胞毒性分析 利用流式細胞術檢測細胞毒性的方法進行分析[15,16]。將靶細胞K562計數(shù),用含1%BSA的PBS重懸至2×106ml-1,并加入CFSE,使CFSE終濃度達到2μmol/L,37℃、10分鐘避光染色。10倍體積預冷的含 10%FBS的 RPMI1640完全培養(yǎng)基終止,1 000 r/min,5分鐘離心,可隱約看到細胞染成黃色,預冷的1%BSA的PBS洗三次;與效應細胞(純化pNK細胞)混合培養(yǎng),效靶比設為6∶1、3∶1和 1.5∶1。用 100 U/ml IL-2 單獨處理作為對照組,100 U/ml IL-2聯(lián)合100 ng/ml Cyr61作為處理組。細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中作用6小時;將細胞混合液取出,流式PBS洗2次,加入PI工作液5μl,避光15分鐘后上流式細胞儀檢測。CFSE和PI雙陽性的細胞為死亡的靶細胞,測量CFSE和PI雙標記細胞的百分比。靶細胞死亡百分比按公式計算:特異性細胞毒百分比=

2 結果

2.1 Cyr61調(diào)節(jié)外周血淋巴細胞中NK細胞的增殖 100 U/ml IL-2、100 U/ml IL-15 和100 ng/ml Cyr61對外周血淋巴細胞處理24小時后,流式細胞儀檢測CD3-CD56+NK細胞在淋巴細胞中的百分比和NK亞群的分布情況。結果發(fā)現(xiàn):3個處理組與對照組相比CD3-CD56+NK細胞的百分比差異都極顯著(P＜0.001),表明Cyr61單獨處理組與IL-2和IL-15作用相同,對NK細胞的增殖有促進作用,但是作用較弱,差異極顯著(P＜0.01,見圖1A)。CD56britht/CD56+比率在各組間沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異(見圖1B)。Cyr61單獨作用與對照組、IL-2和IL-15處理組比較,CD16陽性表達亞群占NK細胞的百分比都降低,差異有顯著性(P＜0.05,見圖1C)。

2.2 Cyr61抑制外周血淋巴細胞中NK細胞的活化性受體表達 100 ng/ml Cyr61聯(lián)合100 U/ml IL-2對外周血淋巴細胞進行處理24小時和48小時,流式細胞儀檢測NK細胞的增殖和抑制性受體和活化性受體表達水平。結果顯示:24小時和48小時的處理組與對照組相比CD3-CD56+NK細胞在總淋巴細胞的比例增加,差異有極顯著性(見圖2A),表明Cyr 61能夠明顯促進NK的增殖。抑制性受體KIR3DL1在24小時的處理組中表達上升,差異極顯著(P＜0.001)?；罨允荏wNKG2D、NKp30和CD244在24小時和48小時處理組與對照組相比表達水平都有顯著性下降(P＜0.001)。而活化性受體NKp44的表達在24小時和48小時處理組與對照組相比表達水平均沒有顯著性變化(見圖2B)。

圖1 Cyr61對外周血淋巴細胞中NK細胞的增殖和亞群分化的作用Fig.1 Cyr61 effects on the proliferative and subset differentiation of NK cells in PBL

2.3 pNK細胞的純度鑒定 采用抗人的CD3和CD56單抗對NK細胞進行直接標記染色,流式細胞儀檢測CD3-CD56+NK細胞在淋巴細胞中的百分比。結果顯示:純化前pNK細胞在淋巴細胞中的百分比為11.42%,經(jīng)過磁珠陰選后NK細胞在淋巴細胞中的百分比達到95.16%(見圖3)。表明pNK細胞純度已達到要求,可以用于其它后續(xù)實驗。

圖2 Cyr61對外周血淋巴細胞中NK細胞的抑制性和活化性受體表達的影響Fig.2 Cyr61 effects on the inhibitory and activating receptor expression of NK cells in PBL

圖3 磁珠陰選的p NK細胞的純度鑒定Fig.3 Purity identification of pNK cell by magnetic negative selection

圖4 Cyr61對純化pNK的抑制性和活化性受體表達的影響Fig.4 Cyr61 effects on the inhibitory and activating receptor expression of purified pNK cells

圖5 Cyr61降低純化p NK細胞的 IFN-γ表達Fig.5 Cyr61 reduces cytokine IFN-γexpression of purified p NK cells

圖6 Cyr61抑制純化p NK細胞的細胞毒性Fig.6 Cyr61 inhibits cytotoxicity of purified p NK cell

2.4 Cyr61提高純化pNK細胞的抑制性受體表達 100 ng/ml Cyr61聯(lián)合100 U/ml IL-2處理磁珠純化的外周血NK細胞48小時,流式檢測NK細胞表面的KIR2DL1、KIR3DL1、NKG2D 、NKp46 和 CD244 陽性表達的百分比。結果顯示:KIR2DL1的陽性表達升高,差異有顯著性(P＜0.05),其它受體沒有檢測出明顯差異(見圖4)。

2.5 Cyr61降低純化pNK的 IFN-γ表達 100 ng/ml Cyr61和100U/ml IL-2聯(lián)合作用對純化pNK細胞處理24小時和48小時后,流式細胞儀檢測pNK的胞內(nèi)IFN-γ表達情況。結果顯示:Cyr61對pNK細胞作用24小時和48小時,均能夠顯著降低NK細胞的IFN-γ表達(P＜0.01)。見圖5。

2.6 Cyr61抑制NK細胞的細胞毒性 Cyr61對純化pNK細胞的細胞毒性的檢測方法采用流式分析方法(見方法1.2.6)。結果顯示:當效靶比是6∶1、3∶1和1.5∶1時,IL-2單獨作用的對照組的細胞毒性分別為7.553%±0.523%、7.917%±0.159%和7.840%±0.136%,而IL-2和Cyr61聯(lián)合處理組的細胞毒性分別為2.467%±0.257%、3.333%±0.159%和4.933 3%±0.505%,處理組與對照組相比,3個效靶比的細胞毒性均表明有顯著差異(分別是P＜0.05、P＜0.01和P＜0.05)。見圖6。

3 討論

Cyr61是富含半胱氨酸的分泌性肝素連接蛋白。研究報道Cyr61在正常的外周血中存在,濃度介于10 ng/ml與100 ng/ml之間,在妊娠期間表達豐富,但是在子癇前期患者的胎盤和外周血清中表達顯著下降[13,17]。本研究主要探討了Cyr61對于外周血NK細胞的增殖、亞群分化、抑制性和活化性受體表達、細胞因子IFN-γ的生成和細胞毒性的作用。

NK細胞的功能如細胞毒性、增殖、趨化和細胞因子的產(chǎn)生都會受到調(diào)節(jié)性細胞因子包括IFN-α、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18 和 TNF 等細胞因子的調(diào)控[18]。IL-2和IL-15的功能性受體分享IL-2受體β和γ鏈,也包括一個獨特的α鏈,即IL-2Rα(CD25)。IL-2和IL-15的作用在一定程度上是重疊的[19]。本研究中采用Cyr61單獨作用可以顯示出與IL-2和IL-15相同的促進NK細胞的增殖作用,但是Cyr61的作用表現(xiàn)較弱。Cyr61作用沒有改變CD56brightNK細胞在總NK細胞中的比例,表明Cyr61的24小時處理對CD56bright和CD56dim的分化是沒有作用的。Cyr61處理pNK細胞引起CD16陽性表達水平降低,提示Cyr61可以抑制抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(Antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)。

Cyr61和IL-2聯(lián)合作用與IL-2對照組相比能夠降低外周血淋巴細胞中NK細胞的活化性受體NKG2D、NKp30和 CD244的表達,提高抑制性受體KIR3DL1的表達,但Cyr61對作用24小時和48小時的KIR3DL1表達影響不同,表明Cyr61對NK細胞上的KIR3DL1受體表達具有時段性。這些結果提示Cyr61能夠通過影響NK細胞的受體表達,從而可能影響由受體傳遞的信號以及細胞因子和細胞毒性的產(chǎn)生。而Cyr61對純化后的NK細胞作用只檢測到抑制性受體KIR2DL1的表達水平升高,對于活化性受體NKG2D、NKp30和CD244的表達均沒有檢測到明顯的差異,提示Cyr61直接促進抑制性受體KIR2DL1的表達水平,但對活化性受體的表達影響不明顯。比較上述不同的結果,推測Cyr61更多地通過對淋巴細胞中其它細胞的作用間接影響NK細胞的表面活化性受體表達降低,從而影響NK細胞的活性。但是是否通過KIR2DL1受體影響NK細胞的IFN-γ產(chǎn)生還有待于進一步研究。

1993年Wegmann等提出在妊娠中存在著從Th1型免疫向Th2型免疫的轉化現(xiàn)象,雖然最初這是從小鼠中得到的證實,但這種觀念提供了一個重要的思想框架:Th2型細胞因子對維持正常的妊娠是很重要的。如果Th1型免疫向Th2型轉變失敗,Th1細胞因子占優(yōu)勢(如IFN-γ分泌增多,而IL-4或IL-10分泌減少)將會導致妊娠疾病如流產(chǎn)或子癇前期的發(fā)生[20]。2002年Darmochwal-Kolarz等證實CD4+和CD8+T細胞的IFN-γ的表達在正常妊娠婦女和子癇前期患者之間沒有改變,但是在子癇前期患者的NK細胞中有高水平的IFN-γ產(chǎn)生[21]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)Cyr61作用NK細胞24小時和48小時均能夠降低NK細胞的IFN-γ表達。表明在正常的妊娠中高濃度的Cyr61是抑制NK細胞的 IFN-γ生成。但是當子癇前期發(fā)生時,血清和胎盤中Cyr61水平顯著下降,NK細胞的IFN-γ分泌增加,促使Th1細胞因子占優(yōu)勢,對妊娠產(chǎn)生不利影響。有研究報道重度子癇前期患者外周血NK細胞的殺傷活性顯著高于正常晚孕組[22]。本研究結果表明,Cyr61能夠抑制外周血NK細胞的細胞毒性。提示Cyr61分子參與對NK細胞的IFN-γ產(chǎn)生和細胞毒性的調(diào)節(jié),可能在子癇前期的發(fā)生中起到一定作用。

4 小結

Cyr61促進外周血淋巴細胞中NK細胞的增殖,降低了CD16陽性亞群的分化;抑制淋巴細胞中NK細胞的活化性受體的表達,促進抑制性受體KIR3DL1的表達;降低純化pNK的IFN-γ表達和細胞毒性,結果提示Cyr61可能差異性地調(diào)節(jié)淋巴細胞中pNK和純化pNK受體的信號轉導。Cyr61在正常妊娠中對外周血NK活性主要起抑制作用,相反,當Cyr61水平顯著下降時,會導致NK細胞的活化,推測這可能是子癇前期發(fā)病的機制之一。

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