黑大蒜提取物對小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答影響的初步探討

馮永輝 王慶輝 王美茹 張 佩 王大南 呂昌龍 (中國醫(yī)科大學(xué)免疫研究所,沈陽110001)

大蒜作為一種常見的植物,性溫味辣,化學(xué)組成十分復(fù)雜,其含有的生物活性成分超過100種。它的藥用價值主要在于其含硫化合物,其含量是洋蔥、椰菜等高有機硫化合物蔬菜的4倍多[1]。人們在實驗中發(fā)現(xiàn)大蒜具有降血脂、降血壓、降血糖、抗腫瘤、抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等功效[2,3]。為此,近些年來人們不斷開展對大蒜的研究,提取大蒜油、制備大蒜粉和合成大蒜素等,用于人類的健康保健,并進(jìn)一步拓寬大蒜的用途。

近年來日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)在控制濕度和溫度的情況下,普通的白大蒜經(jīng)過一定處理可由白色變成黑色(稱為黑大蒜),黑大蒜無白大蒜原有的辣味,反而帶有甜味,口感好,仍可直接食用。已有研究報道黑大蒜較白大蒜含有更多的氨基酸、有機硫和S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine,SAC)[4],因此與白大蒜相比可能更具有應(yīng)用前景。然而目前有關(guān)黑大蒜對機體免疫功能的影響國內(nèi)外少見報道。為此,本實驗應(yīng)用黑大蒜提取物溶液,將其腹腔注射給小鼠,觀察了黑大蒜提取物作為免疫調(diào)節(jié)劑的作用,為黑大蒜的實際應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只BALB/c小鼠,6～8周齡,雌性,體重18～22克,購于中國科學(xué)院上海實驗動物中心。

1.2 黑大蒜提取物溶液的制備及動物注射 黑大蒜粉由日本弘前大學(xué)佐佐木甚一教授提供。黑大蒜提取物按文獻(xiàn)[4]的方法制備,用無菌生理鹽水配制成1 mg/ml溶液。將動物隨機分為8組,每組5只,1～7組為實驗組,第8組為對照組。實驗組小鼠每天腹腔注射0.1 ml的黑大蒜提取物溶液,對照組每天腹腔注射0.1 ml的生理鹽水,連續(xù)注射5天。

1.3 主要試劑 RPMI1640(Thermo)、LDH底物(NBT購自Sigma公司、NAD購自中國科學(xué)院生物研究所、乳酸鈉購自上海試劑三廠、PMS購自Fluka公司)、NP-40(Fluka公司)、Griess反應(yīng)液 (Wako)、Trizol(Invitrogen)、RT-PCR kit(Takara)、IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-αELISA Kit(R&D)、RNA LA PCRTMKit(AMV)Ver.1.1(TaKaRa)、TRIzol(Invitrogen)黑大蒜提取物由日本弘前大學(xué)佐佐木甚一教授惠贈。

1.4 樣品的采集 于末次注射后的第1～7天,從第1組小鼠開始,連續(xù)每天頸椎脫位處死1組小鼠,第8組小鼠于第7天處死。常規(guī)無菌取脾,制備脾細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107ml-1。一部分用于NK細(xì)胞殺傷活性的檢測;另一部分細(xì)胞懸液接種于24孔板中,每個樣品設(shè)3個復(fù)孔,每孔接種0.5ml,置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時,收集上清液用于NO、IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α分泌水平的檢測。

1.5 NK細(xì)胞活性的測定[5]

1.5.1 效應(yīng)細(xì)胞的制備 將上述制備的脾細(xì)胞懸液作為效應(yīng)細(xì)胞,濃度為 1×107ml-1。

1.5.2 靶細(xì)胞的制備 取10%FBS-RPMI1640培養(yǎng)液,傳代培養(yǎng)YAC-1細(xì)胞,將傳代后24小時的YAC-1細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105ml-1。

1.5.3 NK細(xì)胞活性的測定 取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加靶細(xì)胞懸液0.1 ml,實驗組每孔加效應(yīng)細(xì)胞懸液0.1ml,最大釋放組每孔加1%NP-40于靶細(xì)胞中,自然釋放組每孔加RPMI1640液0.1 ml代替效應(yīng)細(xì)胞,置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時,每孔加0.05 ml細(xì)胞培養(yǎng)液,1 500 r/min離心10分鐘,每孔取上清0.1 ml加LDH底物混合液0.1 ml作用20分鐘后,每孔加入30μl終止液,最后用490 nm的濾光片測 OD值,并計算 NK活性。NK細(xì)胞活性(%)=

1.6 NO的檢測(Griess法)[6]收集培養(yǎng)的脾細(xì)胞上清,與等體積的Griess試劑室溫反應(yīng)10分鐘,檢測小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO-2含量。用NaNO2作為標(biāo)準(zhǔn)品,酶標(biāo)儀檢測570 nm處的OD值。

1.7 脾細(xì)胞上清中IL-2、IL-4、IFN-γ和 TNF-α水平的檢測收集的實驗組和對照組小鼠的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清,采用ELISA 法檢測上清中 IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α的水平,具體方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.8 脾細(xì)胞FasLmRNA表達(dá)水平的檢測 按照Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA,然后按照RNA LA PCRTMKit Ver.1.1說明將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以 cDNA為模板,PCR擴(kuò)增FasL及βactin基因片段。FasL 引物:sense 5′-AAT TAC CCA TGTCCCCAGATC-3′,antisense5′-GCTGCTGTGGGC CCA TAT TG-3′;β -actin 引物:sense 5′-TCA GAA GGA CTC CTA TGT GG-3′,antisense 5′-TCT CTT TGA TGT CACGCA CG-3′;PCR循環(huán)參數(shù):95℃變性1分鐘,55℃退火1分鐘,72℃延伸2分鐘,共35個循環(huán);擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后,掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 黑大蒜提取物對BALB/c小鼠NK細(xì)胞的殺傷活性的影響 在連續(xù)5天給予小鼠腹腔注射黑大蒜提取物后,比較實驗組和對照組小鼠的NK細(xì)胞殺傷活性,結(jié)果顯示:與對照組相(5.82%±1.38%)比,黑大蒜提取物處理4～6天后,實驗組小鼠的NK細(xì)胞殺傷活性顯著性升高,并在第 5天達(dá)到峰值(11.21%±1.17%),隨后逐漸下降,結(jié)果見圖1。

2.2 黑大蒜提取物對脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO產(chǎn)生的影響 從黑大蒜提取物處理后的第3天到第7天,實驗組小鼠NO-2始終處于較高的分泌水平,與對照組(11.58±0.86μmol/L)相比,均具有顯著性差異(P＜0.001),結(jié)果見圖2。

圖1 黑大蒜提取物對小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響Fig.1 The effect of black garlic extracts on thecytotoxicity of NK cells

圖2 黑大蒜提取物對脾細(xì)胞培養(yǎng)上清NO分泌水平的影響Fig.2 The effect of black garlic extracts on the NO production in cultured supernatant of spleen cells

圖3 黑大蒜提取物對脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1/Th2細(xì)胞因子的影響Fig.3 The effect of black garlic extracts on the Th1/Th2 cytokines'production in cultured supernatant of spleen cells

圖4 脾細(xì)胞FasL mRNA表達(dá)水平的檢測結(jié)果Fig.4 Thedetection results of FasL mRNA expression in spleen cells Note:M.Marker;1-7.Groups1-7;8.Control group.

表1 脾細(xì)胞FasL mRNA相對表達(dá)水平Tab.1 The relative expression level of FasL mRNA in spleen cells

2.3 黑大蒜提取物對脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1/Th2細(xì)胞因子的影響 在給予小鼠連續(xù)注射5天黑大蒜提取物后,實驗組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2的分泌水平在處理后第 6天有顯著升高,與對照組(20.14±3.88 pg/ml)相比,有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。TNF-α的水平從處理后第1天就開始明顯升高(P＜0.01),在第3天達(dá)到峰值(68.73±0.64 pg/ml),隨后下降,但一直到第7天,均高于對照組(27.36±8.30 pg/ml)。IFN-γ的分泌水平在處理結(jié)束后也有顯著升高,其中在第 3天達(dá)到峰值(105.05±55.73 pg/ml),隨后下降,到第7天接近對照組水平。IL-4的分泌水平在處理后一直低于對照組(19.98±2.13 pg/ml),其中第3、4、5天的表達(dá)水平均顯著低于對照組(P＜0.01),但是變化均在基線范圍內(nèi),見圖3。

2.4 脾細(xì)胞FasL mRNA表達(dá)水平的檢測結(jié)果 通過半定量RT-PCR技術(shù)檢測了小鼠脾細(xì)胞FasL mRNA的相對表達(dá)水平(圖4)。給予小鼠腹腔注射黑大蒜提取物后,各實驗組脾細(xì)胞FasL mRNA的表達(dá)水平與對照組相比均未見顯著性差異(P＞0.05,表1)。這說明黑大蒜提取物刺激機體后,脾細(xì)胞FasL mRNA的表達(dá)并未出現(xiàn)有意義的增強。

3 討論

近年來,有關(guān)大蒜功效的研究者越來越聚焦于大蒜的各種含硫化合物而不是大蒜素。含硫化合物可分為有氣味脂溶性的(如diallyl-disulfide,DADS)和無氣味水溶性的(如SAC)。水溶性的較脂溶性的效應(yīng)功能更為穩(wěn)定。Sasaki等[4]對黑大蒜的成分與普通大蒜的成分進(jìn)行了對比分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者SAC的含量是后者的8倍。進(jìn)一步研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)黑大蒜具有明顯的抗氧化、抗腫瘤和抗菌作用。然而其作用機制尚不清楚,為此本論文從免疫學(xué)角度對黑大蒜的抗腫瘤和抗菌的機制進(jìn)行了探討。

NK細(xì)胞作為參與機體固有免疫應(yīng)答的一類重要細(xì)胞,具有細(xì)胞毒性效應(yīng),能消除機體中的異常細(xì)胞,尤其是病毒感染或腫瘤突變的細(xì)胞。有流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明大蒜的攝取量與胃腸道腫瘤的抑制性具有相關(guān)性[7]。我們的研究結(jié)果顯示黑大蒜能通過增強NK細(xì)胞活性,提高對機體異常細(xì)胞的監(jiān)視、清除功能。但脾細(xì)胞中FasL mRNA的表達(dá)水平未見明顯變化,提示NK細(xì)胞殺傷活性的增強不是通過Fas/FasL殺傷途徑而是可能通過其他途徑來實現(xiàn)的。

NO作為一種非特異性免疫效應(yīng)分子,在誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡、抗菌、抗病毒及胞內(nèi)寄生蟲中,發(fā)揮著重要的免疫防御作用。Pedraza-Chaverrí等[8]曾報道大蒜能促進(jìn)體內(nèi)NO合酶的合成,從而提高NO表達(dá)水平。參與機體免疫應(yīng)答的另一種免疫調(diào)節(jié)因子——TNF-α,不僅能夠直接抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞,而且具有激活巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞功能以及促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖、分化等作用,促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞及其它細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子 IL-1、IL-6、IL-8、IFN-γ以及TNF-α本身,發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。以NO和TNF-α為代表的效應(yīng)分子,對于機體發(fā)揮固有免疫具有重要的意義,本實驗結(jié)果顯示脾細(xì)胞上清中的NO和TNF-α分泌水平在黑大蒜提取物刺激小鼠之后均有提高,進(jìn)一步表明黑大蒜對固有細(xì)胞免疫應(yīng)答具有一定的刺激作用。巨噬細(xì)胞是體內(nèi)這兩種效應(yīng)分子的主要來源,Cho等[9]人報道大蒜素能抑制腹腔巨噬細(xì)胞在缺少營養(yǎng)條件下的凋亡,因此,我們的實驗結(jié)果也間接提示黑大蒜提取物對巨噬細(xì)胞的功能可能具有增強效應(yīng),其具體機制有待于進(jìn)一步深入研究。在本實驗中,以IL-2和IFN-γ為代表的Th1型細(xì)胞因子分泌水平明顯增強,這與黑大蒜在機體抗腫瘤和抗感染的免疫效應(yīng)密切相關(guān),Ghazanfari等[10]發(fā)現(xiàn)大蒜能夠誘導(dǎo)利氏曼原蟲感染的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高水平的IL-2和IFN-γ,但是降低IL-4和IL-10的表達(dá)水平。本實驗中的IL-4分泌水平略有降低,其變化均在基礎(chǔ)范圍內(nèi),我們的結(jié)果表明黑大蒜提取物能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生一種強有力的Th1型免疫應(yīng)答。

本實驗發(fā)現(xiàn)黑大蒜提取物能夠顯著增強NK細(xì)胞殺傷活性,提高NO水平,以及增強Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答,由此提示黑大蒜提取物能明顯增強小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答,這為黑大蒜作為一種免疫調(diào)節(jié)劑在應(yīng)用方面提供了有意義的實驗依據(jù)。有關(guān)黑大蒜提取物的免疫調(diào)節(jié)作用是否優(yōu)于普通的白大蒜有待進(jìn)一步研究。

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