多重PCR法檢測金黃色葡萄球菌耐藥基因及致病毒素基因

王鳳玲，劉國華，侯英榮

（河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科，河北滄州 061001）

感染性疾病是全球最常見的疾病，金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌）是引起化膿性感染的主要病原菌。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，金葡菌的耐藥性逐漸增加，其中耐甲氧西林金葡萄菌（MRSA）的檢出尤為明顯。MRSA的耐藥機制主要是它獲得了含有mecA耐藥基因的可移動遺傳元件，即SCCmec盒。金葡菌能產(chǎn)生和分泌多種毒素[如殺白細胞毒素（PVL）、中毒性休克綜合征毒素-1（TSST-1）、葡萄球菌腸毒素及表皮剝脫性毒素等]，這些毒素已被證明與食物中毒、中毒性休克、皮膚燙傷樣綜合征及作為超抗原功能有關(guān)[1]。因此，非常有必要對金葡菌進行耐藥基因及致病毒素基因的檢測，防止此類細菌的播散。我科對我院臨床分離的金黃色葡萄球菌耐藥基因及致病毒素基因PVL基因和TSST-1基因進行檢測，并對其所引起的感染進行分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

84株金葡菌均為我科2008年1月～2009年1月從臨床標本中分離的菌株，分別來源于痰液、膿液、血液、分泌物、腹腔引流物、腎囊腫穿刺液、胸腔積液、膿皰液、皰液、導管下段及導管尖端，經(jīng)美國DADE-BERING公司W(wǎng)alkAway-40全自動微生物分析儀鑒定核實為金葡菌。

1.2 細菌鑒定質(zhì)控菌株

金葡菌ATCC25923，購于衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.3 儀器與試劑

WalkAway-40全自動微生物分析儀（美國DADE-BERING公司產(chǎn)品），PCR儀（美國Eppendorf公司產(chǎn)品），測序儀（美國ABI公司），凝膠成像儀（美國 FOTODYNE），電泳儀（瑞典Phermacia公司）。PCR試劑購于上海生工生物工程有限公司。

1.4 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中已發(fā)布的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件及參考文獻[2]設(shè)計mecA基因、TSST-1基因、PVL基因引物，擴增產(chǎn)物預(yù)期長度分別為892 bp、578 bp和578 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。

mecA：P15'-GCC GTA GTT GTC GGG TTT GG-3'，P25'-GGC GGA TGT GCG ATT GTA TTG C-3'。

PVL：P15'-GTG ATG GCG CTG AGG TAG TC-3'，P25'，-GCT GGG GGT AAT TCA TTG TCT G-3'。

TSST-1：P15'-GCT ATC GTA AGC CCT TTG TTG C-3'，P25'-GCT GGA TCC GTC ATT CAT TGT T-3'。

1.5 細菌DNA的提取

將冰凍保存的84株實驗菌株用胰酶大豆肉湯復蘇、轉(zhuǎn)種哥倫比亞羊血瓊脂培養(yǎng)基。用接種環(huán)挑取24 h培養(yǎng)的單個菌落，置于 100 μl裂解液（1 mol/L NaOH+20 g/L SDS）中，100℃水浴30 min，冷卻后用等量的1 mol/L鹽酸中和，離心10 min（13000 r/min）去沉淀，再用乙醇沉淀 DNA（加入 400 μl無水乙醇），混勻后-20℃冰凍 30 min，13000 r/min離心15 min，棄上清。 加入 70%乙醇 200 μl，靜置 5 min，13000 r/min離心5 min，吸干上清液，完全晾干沉淀后，用30 μl雙蒸水溶解DNA，作為PCR擴增模板。

1.6 多重PCR擴增體系及反應(yīng)條件

把3對引物放入同一反應(yīng)體系建立多重PCR。PCR體系：采用 20 μl反應(yīng)體系，模板 1 μl，起始引物和終末引物各1 μl，dNTP 1.5 μl，Taq 酶 0.2 μl，10× Buffer 2 μl，Mg2+2 μl，雙蒸水11.3 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，然后進入循環(huán)，94℃變性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸 150 s， 共進行35個循環(huán)，最后72℃延伸15 min，PCR產(chǎn)物在20 g/L的瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后在溴化乙錠溶液中染色20 min，清水沖洗后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.7 序列測定

將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進行測序，結(jié)果與GenBank中的核苷酸序列進行同源性比較。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR擴增產(chǎn)物的電泳分析

84株金葡菌中檢出mecA基因陽性49株，檢出率為58.3%；檢出PVL基因20株，占臨床分離株的23.8%，其中，MRSA 為 13 株（13/49，26.5%），MSSA 為 7 株（7/35，20.0%），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；未檢出TSST-1基因陽性菌株。部分菌株的PVL基因PCR擴增結(jié)果見圖1。

2.2 PVL基因陽性金葡菌的分布特點

PVL基因陽性的分離株中，有7株分離自膿液和創(chuàng)傷分泌物，5株分離自血液，5株分離自痰液，2株分離自腹腔引流物，1株分離自尿液。

2.3 測序結(jié)果的分析

將測序結(jié)果與GenBank中的已有序列進行比較，同源性為100%。

3 討論

最近，國內(nèi)學者報道葡萄球菌已是醫(yī)院感染分離率最高的細菌，其中MRSA占較高的比例[3]。近年來，其臨床分離率呈明顯上升趨勢，因具有多重耐藥特征和攜帶多種毒力因子（如PVL、TSST-1、SEC等）已成為臨床治療的難點。筆者對我院金葡菌感染情況分析發(fā)現(xiàn)，我院MRSA感染占58.3%，MSSA占41.7%，明顯高于馬筱玲等[4]報道的MRSA檢出率（42%），說明我院MRSA感染率較高，并且多為院內(nèi)感染，應(yīng)引起臨床重視。MRSA的甲氧西林耐藥決定簇（mecA）位于SCCmec盒上，該結(jié)構(gòu)類似于轉(zhuǎn)座子，可以介導mecA基因游離傳播，使敏感的金葡菌獲得甲氧西林耐藥；同時SCCmec盒還可以整合許多其他耐藥基因。因此，MRSA菌株常表現(xiàn)為多重耐藥。MRSA的產(chǎn)生還與臨床上抗生素的不合理應(yīng)用有密切關(guān)系。

PVL是金葡菌產(chǎn)生的一種外毒素，該毒素特異性地吸附并作用于白細胞，改變白細胞的通透性，造成大量白細胞損傷，喪失吞噬能力。同時，由于白細胞的破壞，處理抗原和呈遞抗原信息的能力下降，損害了機體的防御屏障和免疫應(yīng)答，從而不能建立有效的特異性免疫。近年來由產(chǎn)PVL金葡菌所致感染而導致死亡病例逐漸增多，尤其是攜帶PVL基因的MRSA[5]。本研究結(jié)果顯示，84株金葡菌中PVL基因陽性的檢出率為23.8%，明顯高于閆中強等[6]報道的PVL基因檢出率（15.7%）。20株P(guān)VL陽性菌株中，7株分離自膿液和創(chuàng)傷分泌物，5株分離直血液，5株分離自痰液，2株分離自腹腔引流物，1株分離自尿液，說明不同臨床標本中都可能檢出PVL陽性的金葡菌，PVL陽性的金葡菌主要造成化膿性感染、肺部感染、血液感染及尿路感染。PVL基因陽性菌株在MRSA中的分離率高于MSSA，PVL基因陽性的MRSA具有多重耐藥性且攜帶PVL，其毒性強，有一定的致死性，將會給患者帶來嚴重的后果。

TSST-1是金葡菌產(chǎn)生的一種產(chǎn)熱毒素，作為超抗原，TSST-1與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合，作用于T細胞受體，使其大量增殖，并產(chǎn)生白細胞介素-1、白細胞介素-2及干擾素等多種細胞因子，是引起中毒性休克的主要原因[7]。本研究對84株金葡菌進行檢測，未檢出TSST-1基因，可能與感染類型不同、其金葡菌攜帶的毒素基因不同有關(guān)。

[1]Becker K,Friedrich AW,Lubritz G,et al.Prevalence of genes encoding pyrogenic toxin superantignes and exfoliative toxins among strains of staphylococcos aureus isolated from blood and nasal soecinens[J].J Clin Microbiol,2003,41(4):1434-1439.

[2]Yamasaki O,Kaneko J,Morizane S,et al.The association between staphylococcos aureus strains carrying panton-valentine leukocidin genes and the development of deep seated follicular infection[J].Clin Infect Dis,2005,40(3):381-385.

[3]姚春艷,府偉靈.葡萄球菌醫(yī)院感染的耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2004,14(1):104-106.

[4]馬筱玲,孫光明,戴媛媛,等.金黃色葡萄球菌耐藥性監(jiān)測[J].臨床輸血與檢驗雜志,2007,9(1):18-20.

[5]Lopez-Aguilar C,Perez-Roth E,Moreno A,et al.Association between the presence of the panton-valentine leukocidin-encoding gene and a lower rate of survival among hospital pulmonary patients with staphylococcal disease[J].J Clin Microbiol,2007,45(1):274-276.

[6]閆中強,沈定霞,羅燕萍,等.多重PCR檢測臨床分離金黃色葡萄球菌Luks/PV基因和mecA基因[J].中國感染與化療雜志,2008,8(4):255-259.

[7]Nakagawa S,Kushiya K,Taneike I,et al.Specific inhibitory action of anisodamine against a staphylococcal superantigenic toxic,toxic shock syndrome toxin 1(TSST-1),leading to down-regulation of cytokine production and blocking of TSST-1 toxicity in mice[J].Clin Diagn Lab Immunol,2005,12(3):399-408.