喀斯特地區(qū)白三葉形態(tài)和遺傳多樣性研究

李莉，王元素，洪紱曾

1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院草地所，北京 100094；3.貴州省草原監(jiān)理站，貴州 貴陽 550001

白三葉（Trifolium repens）是溫帶最重要的豆科牧草，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，家畜喜歡采食[1]，其根際共生根瘤菌固定大氣中的氮，因此，是減少N肥施用的最佳選擇，已經(jīng)在有機(jī)農(nóng)場(chǎng)廣泛應(yīng)用[2]。白三葉是我國(guó)喀斯特地區(qū)混播草地中最穩(wěn)定的牧草種群之一[3,4]，而且侵襲性最強(qiáng)[5]，一些研究并在競(jìng)爭(zhēng)與共存方面探索了穩(wěn)定機(jī)理。

從分子生態(tài)學(xué)的角度探討白三葉形態(tài)進(jìn)化、遺傳多樣性與種群穩(wěn)定持久性的關(guān)系方面，國(guó)內(nèi)外的研究不多，國(guó)內(nèi)只有張賢等人（2006）研究了白三葉遺傳空間多態(tài)性[6]。由于白三葉基因多樣性受微環(huán)境的影響很大，不同地區(qū)其遺傳變異性不盡相同。因此，開展白三葉空間和時(shí)間上的遺傳多樣性研究，對(duì)理解喀斯特地區(qū)白三葉種群的穩(wěn)定持久性有重要的意義。

1 研究方法

在貴州省威寧縣對(duì)3個(gè)不同年限的白三葉地塊進(jìn)行調(diào)查，收集種子進(jìn)行溫室培養(yǎng)，分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀測(cè)；取新生葉片進(jìn)行DNA提取與擴(kuò)增，分析遺傳多樣性。

1.1 樣地描述

A：100年白三葉。威寧縣石門坎鄉(xiāng)，英國(guó)傳教士柏格理(Samuel Pollard) 1900年到1915年在貴州威寧一帶傳教，在石門坎苗族聚居地建立教會(huì)學(xué)?！T坎中學(xué)，于 1906年從英國(guó)帶來白三葉、多年生黑麥草（Lolium perenne）等牧草，于 1906—1908年建植了一塊白三葉作為綠化觀賞，并建設(shè)了一個(gè)草坪足球場(chǎng)和一個(gè)足球練習(xí)場(chǎng)[7]。2006年6月調(diào)查時(shí)白三葉和草地早熟禾（Poa pratensis）仍有相當(dāng)比例，侵入的雜草主要有平車前(Plantago depressaWilld.)。種子主要取自足球練習(xí)場(chǎng)。

B：40年白三葉。1965年，貴昆鐵路通車，在威寧金鐘鎮(zhèn)有一小站—樹舍。威寧黑山羊久負(fù)盛名，特別在石門坎等苗族聚居區(qū)，喜歡養(yǎng)山羊。從1965—1970年，威寧縣食品公司組織羊只用人趕往樹舍火車站裝車（從石門坎山羊養(yǎng)殖地到火車站距離大約120 km）。1965開始，由山羊傳播的白三葉就長(zhǎng)滿了沿途路邊和火車站周圍。2006年9月采集種子。

C：20年白三葉。1985年在灼圃示范牧場(chǎng)播種的混播試驗(yàn)地。2006年9月采集種子。

1.2 形態(tài)學(xué)測(cè)定

種床準(zhǔn)備：50格種苗培養(yǎng)盤，每格規(guī)格 10 cm×10 cm；床土為m(石英砂)︰m(細(xì)土)︰m(腐殖質(zhì))=3︰4︰3混合而成，高壓滅活。

種子處理：播種前為破除硬實(shí)，用細(xì)砂與種子混合，沙磨。

播種：每個(gè)樣種50格，每格10粒種子，澆透水后播種，覆土1 cm。

管理：澆水按需進(jìn)行，晴天每天一次，陰天2～3 d一次。N、P、K全肥每2月一次，滿足生長(zhǎng)需求。成苗后間苗，每格只留下1株苗。

監(jiān)測(cè)指標(biāo)：中葉長(zhǎng)、寬以及長(zhǎng)寬比，葉質(zhì)量，莖質(zhì)量，葉高，生長(zhǎng)點(diǎn)個(gè)數(shù)，匍匐莖長(zhǎng)度等。

1.3 遺傳多樣性分析

白三葉分子標(biāo)記采用張賢等人（2006）[6]的優(yōu)化 RAPD分析條件。10堿基隨機(jī)引物(5′GTGACGTAGG 3′) 購自上海生工公司。100bp DNA ladder、Taq DNA聚合酶、dNTP購自天為時(shí)代公司。PCR儀為PTC200型，電泳儀為DYY-6B型。

方法概述如下：白三葉DNA提取和RAPD反應(yīng)程序及其優(yōu)化條件參照張賢等（2006）[6]。遺傳多樣性用Alpha Imager 2200軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白三葉形態(tài)學(xué)特性分析

不同時(shí)間和空間的白三葉形態(tài)學(xué)特征有很大的差異性（表1）。開始分枝即80日齡的單株葉片數(shù)以C樣（100年草地）的最高，顯著高于A樣（20年草地）和B樣（40年草地）(P<0.05)，但種群內(nèi)的變異系數(shù)也最高，分別比A樣和B樣高出20.39和25.85個(gè)百分點(diǎn)，單株葉片數(shù)最多的是最少的16倍。A樣和B樣的葉片數(shù)、變異系數(shù)和數(shù)量范圍都非常接近。

表1 白三葉形態(tài)學(xué)數(shù)量性狀分析Table 1 Visible traits of white clover

到5月齡時(shí)，單株葉片數(shù)與80日齡時(shí)有所不同。平均單株葉片數(shù)以A樣的最低(P<0.05)，只有B樣和C樣的70%左右。但種群內(nèi)變異系數(shù)最大的仍然是C樣，分別比A樣和B樣高18.83和23.27個(gè)百分點(diǎn)，最多株是最少株的32倍。B樣和C樣的變異系數(shù)接近。

5月齡時(shí)第 3葉片中葉的長(zhǎng)度以 A樣的最長(zhǎng)(P<0.05)，分別是B樣和C樣的110%和118%；三個(gè)樣地的種群內(nèi)變異系數(shù)很接近，在 20.58%～23%之間，最低與最大值范圍也非常接近。

5月齡第三葉片的寬度三個(gè)樣地之間差異顯著(P<0.05)，最寬的是A樣，其次是B樣，寬度最小的是C樣。三個(gè)樣地種群內(nèi)變異系數(shù)范圍在20%左右，A、B、C樣種群內(nèi)葉寬最大值分別是最小值的2.91、2.55和2.40倍，而種群之間差異不大。

中葉長(zhǎng)寬比主要用來描述葉片的形狀。長(zhǎng)寬比值以C樣的最大(P<0.05)，其比值大于1，說明C樣的葉長(zhǎng)大于寬，為橢圓形；A和B樣的比值都小于1，說明二者的葉片多為心形。三個(gè)樣地的種群內(nèi)變異系數(shù)都不大，表明葉形是穩(wěn)定的形態(tài)學(xué)性狀。

葉片高度以A樣最高(P<0.05)，分別比B樣和C樣高出14.46%和21.87%。三個(gè)樣的種群內(nèi)變異系數(shù)比較大，都接近30%。

每株的生長(zhǎng)點(diǎn)個(gè)數(shù)以A樣的最少，分別比B樣和C樣低30.37%和31.91%。但三個(gè)樣種群內(nèi)的變異系數(shù)都很大，其中最高的是C樣（64.42%），分別比A樣和B樣高出18.36和15.68個(gè)百分點(diǎn)。

單株匍匐莖長(zhǎng)度（分枝長(zhǎng)）用來顯示白三葉的侵占力和地上生物量。匍匐莖最短的是 A樣(P<0.05)，僅相當(dāng)于 B樣和 C樣的 36.39%和34.70%。三個(gè)種群的變異系數(shù)卻非常高，分別為128.69%、108.31%和138.87%。比如C樣中，最短的一株還沒有分枝，而最長(zhǎng)的已經(jīng)達(dá)到47.50 cm，說明種群內(nèi)個(gè)體之間差異非常大。

基于5月齡各形態(tài)學(xué)變量之間Pearson Correlation進(jìn)行的系統(tǒng)樹狀聚類圖見圖1，可以看出，葉數(shù)、生長(zhǎng)點(diǎn)和分枝長(zhǎng)度有很緊密的相關(guān)性，白三葉分枝越長(zhǎng)，生長(zhǎng)點(diǎn)個(gè)數(shù)越多，葉數(shù)就越多。而中葉的長(zhǎng)寬比（即葉形）與葉層高、中葉長(zhǎng)、中葉寬相關(guān)，其中葉層高與中葉長(zhǎng)相關(guān)性高。

圖1 白三葉形態(tài)學(xué)變量相關(guān)性聚類樹狀圖Fig.1 Hierarchical cluster of Pearson correlation of morphyologocal variables

圖2 三個(gè)年齡白三葉種子溫室培養(yǎng)Fig.2 Cultivating in glasshouse

圖2直觀地表現(xiàn)了三個(gè)時(shí)間段白三葉形態(tài)學(xué)特征的差異。溫室培養(yǎng)80日齡時(shí)，100年和50年的已經(jīng)開始分枝，葉數(shù)多，而20年的個(gè)體小，基本上沒有分枝，葉數(shù)少。到180日齡，100年白三葉分枝多、匍匐莖長(zhǎng)，葉片茂密、斜生，20年的仍然分枝很少，葉片少而直立；而40年的介于二者之間。

在溫室培養(yǎng)180日后，對(duì)所有植株進(jìn)行質(zhì)量相關(guān)特征的分析。結(jié)果表明（表2），三個(gè)不同年齡草地處理的平均單株葉質(zhì)量、根質(zhì)量、地上生物量、地上DM與地下DM的比值等指標(biāo)數(shù)值接近，差異不顯著。但是，與莖有關(guān)的指標(biāo)如莖質(zhì)量等差異顯著。即草地年限越大的白三葉，莖的生物量越高。20年草地（A）的莖質(zhì)量和莖根質(zhì)量比值顯著低于40年（B）和 100年草地的（C）（P<0.05），只分別為B和C的57%～47%。而A的葉莖比值顯著高于B、C草地的（P<0.05），分別為B和C的2倍和4倍。

葉質(zhì)量、莖質(zhì)量、根質(zhì)量、地上生物量等指標(biāo)的種群內(nèi)變異系數(shù)則隨著草地年限的增加而增大。如20年草地的個(gè)體變異系數(shù)為0.451，而100年的則為 0.950，增大了 1倍多。葉莖質(zhì)量比、莖根質(zhì)量比、地上與地下生物量等比值則變異系數(shù)相似，不隨草地年限的增加而變化。

表2 白三葉質(zhì)量特征分析Table 2 Weight-related traits of white clover1)

2.2 白三葉遺傳多樣性分析

從圖3和圖4可以看出，不同年齡的白三葉遺傳多樣性差異顯著。20年白三葉有14個(gè)等位基因，而100年白三葉只出現(xiàn)8個(gè)等位基因（40年的由于保存失誤，使樣品損壞）。20年白三葉中，等位基因M頻率最高，為17.24%，其次為F和K，均為10.34%，最低的是A、B、H、L，都只出現(xiàn)3.45%。100年白三葉，等位基因K頻率最高，為32.26%，其次為E，16.13%，而等位基因B、C、F、L、M、N都沒有出現(xiàn)，頻率為0。

圖3 不同年齡段白三葉RAPD標(biāo)記Fig.3 RAPD of two ages white clovers

圖4 不同年限白三葉基因頻率分析Fig.4 ALLEL frequance of two different age white clovers

3 討論與結(jié)論

隨著年限的增加，白三葉形態(tài)學(xué)特征發(fā)生變化以適應(yīng)環(huán)境，單株葉數(shù)、生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)、中葉長(zhǎng)、中葉長(zhǎng)寬比以及種群內(nèi)個(gè)體之間變異性隨著年限的增加而增加，而葉層高度、中葉寬則下降。三個(gè)不同年齡草地處理的平均單株葉質(zhì)量、根質(zhì)量、地上生物量、地上生物量與地下生物量的比值等指標(biāo)數(shù)值接近，差異不顯著(P>0.05)。但是，與莖有關(guān)的指標(biāo)如莖質(zhì)量等差異顯著。這是白三葉為適應(yīng)踩踏和或家畜采食而產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)變化。植物個(gè)體水平上對(duì)利用或放牧有兩種響應(yīng)對(duì)策：短期發(fā)生生理反應(yīng)以應(yīng)對(duì)光和組織被采食后碳水化合物的供給不足；長(zhǎng)期則發(fā)生形態(tài)學(xué)的變化進(jìn)化“回避”機(jī)制以減少被采食的機(jī)會(huì)而持久存在[8]?！盎乇堋笔侵笢p少被采食的可能性和強(qiáng)度，其機(jī)理包括結(jié)構(gòu)特性、物理特性和化學(xué)物質(zhì)的變化，“忍耐”機(jī)理則包括被牧食后殘留分生組織來源和有效性以及促進(jìn)再生的生理過程[9]。在長(zhǎng)期放牧下“回避”型植物呈墊伏狀，“回避”機(jī)制可能比“忍耐”機(jī)制更有效[10]。本研究中，白三葉隨年限增長(zhǎng)，葉片數(shù)減少，而莖生物量增加，這是“回避”機(jī)制的結(jié)果。Rhoades（1985）[11]把回避機(jī)制隨放牧強(qiáng)度增加而增強(qiáng)的現(xiàn)象叫誘導(dǎo)防御（inducible defences）。白三葉雖然對(duì)環(huán)境因素敏感，對(duì)干旱、霜凍和蔭蔽耐受力差，但耐重牧和踩踏[12]。白三葉的匍匐莖貢獻(xiàn)很大的生物量，它緊貼地面生長(zhǎng)，不容易被采食和損害[4]。

100年白三葉的等位基因數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)沒有 20年的高，這是因?yàn)?，首先，白三葉是嚴(yán)格的異花授粉植物，在利用條件下以營(yíng)養(yǎng)生殖為主，以種子自熟下繁為輔；一般認(rèn)為在基因流方面有大面積的連續(xù)分布[2]。一個(gè)白三葉植株可產(chǎn)生很多的匍匐莖和分枝，從而形成一個(gè)由眾多克隆構(gòu)件組成的占據(jù)一定面積的體系。這樣的克隆斑塊可從幾平方厘米到幾平方米的面積[13]。經(jīng)過100年的變遷，白三葉種群很可能由少數(shù)的大克隆體占統(tǒng)治地位，增加了取樣幾率。第二，100年白三葉所在地位置偏遠(yuǎn)，交通極不發(fā)達(dá)，外來白三葉基因的侵入機(jī)會(huì)較??；而 20年白三葉位于灼圃示范牧場(chǎng)，引進(jìn)的其他白三葉品種增加了基因漂流和融合的機(jī)會(huì)。

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