芳香族羧酸的液相色譜分析進展

楊媚 吳艷征

（1 哈爾濱師范大學(xué) 2 上海實驗中學(xué)劍橋教育中心)

1 引言

芳香族羧酸是有機酸中重要的一部分，它們在食品、藥物等生活和生產(chǎn)中有著很重要的應(yīng)用，因此鑒定、分離和定量分析芳香族羧酸是非常必要的。目前對于脂肪酸及無機酸的分離方法較多，而分析芳香族羧酸的報道相對較少。芳香族羧酸常用到的分離方法有氣相色譜、高效液相色譜、毛細管電泳和離子交換色譜等[1,2,3]。本文將著重對芳香族羧酸的液相色譜分析方法進行系統(tǒng)闡述。

2 芳香族羧酸的反相液相色譜分析

反相色譜法（RPC）一般采用非極性固定相(如C18、C8)，流動相為水或緩沖液。常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)整保留時間，主要適用于分析非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個HPLC應(yīng)用的80%左右。當(dāng)采用RPLC法分離有機酸混合物時[5]，流動相的組成和性質(zhì)對色譜保留行為有重要的影響，一些學(xué)者考察了流動相中pH值、各組分體積分數(shù)及流速對分離結(jié)果的影響，以便尋找最佳分離條件。

例如，芳香族羧酸中的苯甲酸在食品、藥品、化妝品等生活用品中常被作為防腐劑的主要成分。一些學(xué)者采用反相液相色譜對苯甲酸進行了檢測（見表1）。

酚酸類物質(zhì)是酚類物質(zhì)的一種，多為對羥基苯甲酸和對羥基肉桂酸的衍生物，具有營養(yǎng)和抗氧化等藥理活性和藥用價值，與人體健康密切相關(guān)[18,19]。Hakkinen S[20,21]用ODSHypersil柱以磷酸二氫銨：正磷酸：磷酸二氫銨與乙腈混合液為流動相分離漿果內(nèi)的阿魏酸、咖啡酸在內(nèi)的6種酚酸，之后分析了藍莓果實。而在對酚酸的高效液相檢測上Neira[22]等采用反相Nova Pack C18,乙腈：水：乙酸流動相，分離了沒食子酸等8種酚酸。索志榮[23]等采用反相高效液相色譜簡化學(xué)檢測法，用甲醇-2%醋酸為流動相，建立了測定葡萄酒中4種酚酸的色譜電化學(xué)分析方法，并用該方法測定了5種國內(nèi)不同品牌的葡萄酒。翁芳華[24]等以甲醇-乙酸-水溶液為流動相，建立了一種新的同時測定藍莓酒中沒食子酸等11種酚酸含量的高效液相色譜法，并測定了藍莓酒發(fā)酵樣中酚酸的含量。

3 芳香族羧酸的反相離子對液相色譜分析[4]

70年代末以來，離子對這最初被用于提高溶劑萃取的選擇性的技術(shù)被引入到反相色譜中，用于有機酸和有機堿的分離，使得反相色譜分離分析技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域大為擴展。近年來，離子對色譜法又被逐步用于無機陰離子和陽離子絡(luò)合物的分離分析中?？梢哉f離子對色譜法是反相色譜技術(shù)和離子色譜法技術(shù)的引申和發(fā)展，已成為一種廣泛采用的液相色譜分離方法。

離子對反相色譜（RP-IP）和反相液相色譜中分離過程中所采用的柱和流動相很相似[4]，不同的主要是離子對反相色譜的流動相中加入了離子對試劑。其原理是將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配。離子對試劑的結(jié)構(gòu)和濃度也會影響樣品的保留值。

E. G. Sumina[25]等人利用反相離子對薄層色譜法和高效液相色譜法對苯甲酸進行了檢測，得到了較滿意的分析結(jié)果。伍發(fā)興[26]采用離子對色譜法，在zorbax Eclipse XDB-C8柱上，快速測定含乳飲料中的糖精鈉、苯甲酸和山梨酸的三種食品添加劑含量。在試驗濃度范圍5～200mg／L內(nèi)均呈良好線性。三種添加劑的檢測限分別為5ng、4ng、4ng。楊曉莉[27]等利用反相離子對高效液相色譜梯度洗脫建立復(fù)方硝酸益康唑乳膏含量測定的方法。色譜柱為辛烷基硅烷鍵合硅膠柱，檢測波長227nm，內(nèi)標物質(zhì)為對羥基苯甲酸乙酯。本法可同時測定復(fù)方硝酸益康唑乳膏中硝酸益康唑、曲安奈德、苯甲酸的含量。

4 芳香族羧酸的離子（交換）色譜分析

離子交換色譜的分離機理主要是離子交換，是基于離子交換樹脂上可離解的離子與流動相中具有相同電荷的離子之間進行的可逆交換。是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換反應(yīng)是可逆反應(yīng)，這種反應(yīng)是在固態(tài)的樹脂和水溶液接觸的界面間發(fā)生的。在水溶液中，連接在離子樹脂骨架上的功能基能離解出可交換的離子B+，該離子在較大范圍內(nèi)可以自由移動，并能擴散到溶液中。同時，溶液中的同類型離子A+也能擴散到整個樹脂結(jié)構(gòu)內(nèi)部，這兩種離子之間的濃度差推動著它們之間的交換。其濃度差越大，交換速度就越快。離子交換色譜在分離低分子有機酸方面，無須對樣品進行復(fù)雜的預(yù)處理，能夠很好地分離和同時檢測多種有機酸物質(zhì)[28]。

許龍福[29]探討了用強陽離子交換柱同時測定食品中糖精、苯甲酸、山梨酸、檸檬酸及蘋果酸的可行性。以c(1/2 H2SO4)=0.0005ml/L作流動相，在230nm下分離測定。可完全分離測定上述5種添加劑，相關(guān)系數(shù)在0.9993以上，乳化劑及甜味素不干擾?？捎脧婈栯x子交換柱代替反相柱同時測定以上5種添加劑，應(yīng)用于果奶等測定結(jié)果滿意。

分析芳香族羧酸更多時候采用某些強陰離子交換色譜柱。早在1974年，Kil Sang. Lee[30]等人就采用陰離子交換色譜法測定了水楊酸和它的衍生物。郜志峰[31]采用陰離子分析柱，淋洗液為0.75mmol/L鄰苯二甲酸測定農(nóng)藥綠康寧中的苯甲酸和硫酸根離子，可同時分析有機酸和無機陰離子。徐海波[32]、陳利根[33]等分別對上述離子交換色譜的條件做了進一步的優(yōu)化和探討。M. A. M. Aboul-Soud[34]等人采用高效離子交換色譜法對水楊酸進行了檢測，亦取得了較好的分析結(jié)果。2005年，鐘志雄[35]等采用離子交換-電導(dǎo)檢測離子色譜法測定食品中的甜蜜素和苯甲酸。選用25.0mmol/L NaOH+5%甲醇淋洗液，外接水自動再生，樣品經(jīng)沉淀處理，過濾后進樣分析。該方法的線性范圍廣、相關(guān)性較好。2008年，張嘉捷[36]等鑒于離子交換色譜中被測離子和有機聚合物樹脂之間存在的吸附作用，選擇陰離子交換色譜柱，針對離子交換色譜中的吸附保留行為，從色譜混合保留機理的角度出發(fā)，以含50%乙腈(V/V)的9mmol/L Na2CO3為流動相，對12個不同結(jié)構(gòu)類型的無機和有機陰離子(氟離子、氯離子、硫酸根、磷酸根、二羥基丁酸、丙酮酸、乙酸、丙烯酸、苯甲酸、丙二酸、酒石酸和鄰苯二甲酸)的保留行為進行研究，并采用推導(dǎo)所得的混合保留機理模型對溶質(zhì)這一保留特征進行表征，結(jié)果較為理想,為離子交換色譜中吸附保留行為的研究提供了新方法。

目前，離子交換色譜的使用與其它色譜相比可能不是那么頻繁[4]，雖然很多時候離子對液相色譜由于其柱子的高效性、易控制等因素使用起來更為方便，但當(dāng)有機離子有較弱的紫外吸收或需要電導(dǎo)檢測時，更多時候選擇離子交換色譜。

5 芳香族羧酸的離子排斥色譜分析

離子排斥色譜是在離子交換色譜法前就由Wheaton和Bauman于 l953年提出來的

分離技術(shù)。在 l975年離子交換色譜法問世之后 ，該技術(shù)又重新引起人們的重視。近年來離子排斥色譜主要應(yīng)用于分離測定弱離解的有機酸、無機酸及某些分子型樣品。隨著分析方法的改進，相關(guān)的文獻報道也逐漸增多。離子排斥色譜法能夠應(yīng)用的主要原因是[37]：①極適合于含水基體；②對強親水性和強揮發(fā)性的物質(zhì)不會造成損失；③只需簡單的樣品前處理，不需柱前衍生作用；④有機酸的分析幾乎不受無機陰離子的干擾；⑤可聯(lián)合其它的色譜分析方法，實現(xiàn)二維分離。

離子排斥色譜的分離理論是由Donnan排斥原理發(fā)展而來的[37]。IEC的分離柱填料一般是有一定交聯(lián)度的（8%）、總體磺化的H+型高容量陽離子交換樹脂。樹脂的電荷密度較大，導(dǎo)致在樹脂顆粒間隙的液體和樹脂微孔內(nèi)吸留的液體間形成一個“半透膜”。溶質(zhì)陰離子（如Cl-）由于受Donnan排斥，不能進入樹脂微孔內(nèi)，因此不被保留，而非離子型的中性分子，如有機酸、醇類等，則不受Donnan排斥的影響，可通過“半透膜”進入樹脂的微孔內(nèi)，有保留作用。此方法可成功地分析無極弱酸（如硼酸、氟、亞砷酸、氫氰酸、氫碘酸、硅酸、亞硫酸和碳酸）和大量有機酸，也可用于醇類、醛類的分析。

現(xiàn)代排斥色譜理論是1978年Turkelson等提出的[38]。他們用稀酸代替水作流動相，由于低pH值的洗脫液抑制酸的離解，這時pK1小于洗脫液pH值的組分被排斥不進入膜內(nèi)，反之被保留。洗脫液的pH值越低，即其酸濃度越高，保留時間越長。有機酸的保留主要受酸離解程度(pKa值)影響[39,40]，同時也受酸在固定相上吸附分配的影響[40]。有作者指出[41]，待測有機酸的pK1只有2.7～5才能被較好地分離。在性質(zhì)相似的酸中，pK1越大，洗脫越慢，即保留體積越大。例如容易離解的有機酸在柱上保留弱，則保留時間短，先流出；不易離解的有機酸，在柱上保留時間長，后流出。

Ng等人[42]在三種不同強酸型陽離子交換劑固定相上（磺化的聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸酯、硅基），使用14種不同pH值的淋洗液，得到了13種選定羧酸(包括一元、二元脂肪酸和芳香酸的保留數(shù)據(jù))。結(jié)果顯示，疏水性吸附作用對IEC法分析含三個及三個以上碳原子的一元脂肪酸和芳香酸起主要作用。李海燕[43]以0.005mmol/L硝酸為淋洗液，用電導(dǎo)離子排斥色譜法測定飲料中作為防腐劑的苯甲酸，在H+型陽離子交換樹脂得到苯甲酸與飲料中其它組分的良好分離。對普通樣品只需經(jīng)過稀釋即可進行進樣，分析時間很短（小于6分鐘）。2008年，于泓等人[44]研究了直接電導(dǎo)檢測-離子排斥色譜法分離測定芳香族羧酸（鄰苯二甲酸、水楊酸、苯乙酸、對羥基苯甲酸、苯甲酸和鄰甲苯甲酸）。以Shim-pack、SCR-102H色譜柱為分離柱，H2SO4為流動相，考察了流動相濃度、色譜柱溫度、流速對分離和測定芳香族羧酸的影響。本方法用于醬油樣品的分析得到滿意結(jié)果。2009年，肖坤[45]等人以硝酸為淋洗液，應(yīng)用離子排斥色譜法測定了飲料中的苯甲酸含量，樣品預(yù)處理簡單，分析時間較短，該方法的靈敏度滿足實際測定要求。然而，也有些芳香族羧酸用常規(guī)離子排斥色譜法檢測是比較困難的。因此Tanaka等人[46]提出了一種IEC新方法---“反離子排斥色譜法”（Vacancy Ion –Exclusion ChromatograpHy）。Ohta等[47]研究了芳香族羧酸在幾種陰離子交換樹脂柱上用H2SO4作淋洗液的離子排斥色譜分離，Helaleh等[48]研究了用反離子排斥色譜將樣品溶液作流動相，含甲醇的水溶液作試樣，在弱酸陽離子交換樹脂柱上分離了硫酸、萘四羧酸、鄰苯二甲酸和苯甲酸，結(jié)果令人滿意。

6 結(jié)束語

反相液相色譜、反相離子對色譜、離子（交換）色譜及離子排斥色譜的應(yīng)用和結(jié)合，擴大了液相色譜法在有機酸測定方面的應(yīng)用，為分離和測定芳香族羧酸提供了很好的選擇。由于這幾種方法有多種分離方式和多種性能各異的色譜柱可供選擇，又可選擇不同的流動相，不僅使芳香族羧酸的分析具有較高的靈敏度和較好的選擇性，而且改進了分析復(fù)雜樣品的能力。

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