克隆啟動(dòng)子方法的比較及應(yīng)用

郝迪 ，趙 琳，陳李淼，李文濱

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大豆研究所，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

隨著基因工程的發(fā)展，常常需要構(gòu)建一種能高水平表達(dá)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。啟動(dòng)子對(duì)外源基因的表達(dá)水平影響很大，是RNA聚合酶能夠識(shí)別并與其結(jié)合、從而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，是基因工程表達(dá)載體的重要元件?；騿?dòng)子的克隆，對(duì)研究植物基因表達(dá)調(diào)控和構(gòu)建表達(dá)載體至關(guān)重要。文章就近幾年來(lái)克隆植物基因啟動(dòng)子的各種方法做一綜述，為啟動(dòng)子分離技術(shù)的應(yīng)用提供理論參考。

1 啟動(dòng)子克隆的幾種方法

1.1 PCR技術(shù)克隆啟動(dòng)子

對(duì)于序列已知的啟動(dòng)子，即根據(jù)發(fā)表的基因序列，設(shè)計(jì)引物，用PCR技術(shù)克隆基因的啟動(dòng)子。由于PCR法簡(jiǎn)便快捷，近年來(lái)被較多應(yīng)用于克隆基因啟動(dòng)子。

Wang等根據(jù)GenBank中擬南芥基因組序列中ats1A（核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基）基因的前部疑似啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)引物，以擬南芥總DNA為模板，PCR擴(kuò)增出ats1A的基因啟動(dòng)子區(qū)片段[1]。蘇寧等根據(jù)已報(bào)道的水稻葉綠體16S rRNA基因前部疑似啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)引物，以水稻葉綠體DNA為模板，PCR擴(kuò)增出16S rRNA基因5'啟動(dòng)子區(qū)的片段。同源比較結(jié)果表明，所克隆的片段與水稻葉綠體16S rRNA啟動(dòng)子序列具有100%的同源性?？梢?jiàn)，該方法簡(jiǎn)便、快捷、操作簡(jiǎn)單，但不能克隆到全新的啟動(dòng)子[2]。

1.2 I-PCR技術(shù)

I-PCR又稱反向PCR（Inverse-PCR），是1988年由Triglia最早提出的一種基于PCR的改進(jìn)的染色體步行方法。I-PCR的試驗(yàn)程序包括，基因組DNA經(jīng)酶切后用T4DNA連接酶進(jìn)行自連接，產(chǎn)生環(huán)狀DNA片段；以環(huán)化產(chǎn)物為底物，用根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而得到含有未知片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，見(jiàn)圖1[3]。

Forester等用該方法克隆了豌豆種子脂肪加氧酶基因啟動(dòng)子，約800 bp片段[4]。韓志勇等以IPCR技術(shù)為基礎(chǔ)克隆了轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因旁側(cè)序列[5]。

I-PCR法快速、高效、穩(wěn)定，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，花費(fèi)少，PCR引物設(shè)計(jì)比較方便。

1.3 P-PCR技術(shù)

P-PCR（Panhandle PCR）是由Jones等提出的利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀單鏈模板，有效增強(qiáng)了引物與模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)需要3個(gè)根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的引物，3個(gè)引物在已知序列內(nèi)呈線性排列，其中第3個(gè)引物可作為接頭使用，可與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成鍋柄狀單鏈模板（見(jiàn)圖 2）[6]。

黃君健等成功地應(yīng)用P-PCR技術(shù)從正常的人外周血單核細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增端粒催化亞基hTERT基因5'端上游旁側(cè)序列，獲得了hTERT基因翻譯啟始位點(diǎn)上游2 090 bp的基因組DNA序列[7]。

圖1 I-PCR原理Fig.1 Sketch map of I-PCR

圖2 鍋柄PCR原理Fig.2 Sketch map of P-PCR

P-PCR是目前能夠擴(kuò)增距已知序列最遠(yuǎn)的未知DNA序列的方法，有很高的特異性。

1.4 錨定PCR技術(shù)

錨定 PCR（Anchored PCR）是由Huang等提出的擴(kuò)增已知序列側(cè)翼未知片段的方法。反應(yīng)中需要2個(gè)根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的引物，2個(gè)根據(jù)載體序列設(shè)計(jì)的引物，然后分別利用一條已知序列特異性引物和載體上非特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其操作一般包括3輪PCR擴(kuò)增，第1輪采用不對(duì)稱PCR的方法，在擴(kuò)增時(shí)使用兩種引物濃度不同，一般高濃度引物與低濃度引物比為（50～100）∶1，在最初10～15個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，待低濃度引物耗盡后，繼續(xù)由高濃度引物介導(dǎo)產(chǎn)生大量單鏈DNA。第2輪中，把第1輪PCR產(chǎn)物稀釋后做模板，引物為相同濃度的特異性引物和非特異性引物，這一輪可得到雙鏈DNA。第3輪PCR目的主要是檢測(cè)所得PCR產(chǎn)物是否為預(yù)期產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖3[8]。

圖3 錨定PCR的流程Fig.3 Schematic diagram of anchored PCR method

范云等用錨定PCR克隆了胡蘿卜AFP（抗凍蛋白）基因上游序列[9]。

此方法需要知道啟動(dòng)子相鄰序列，且要構(gòu)建基因組文庫(kù)。

1.5 探針載體篩選啟動(dòng)子

利用啟動(dòng)子缺失的報(bào)告基因構(gòu)建啟動(dòng)子探針質(zhì)粒，通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)克隆有啟動(dòng)功能的DNA片段。在該技術(shù)中關(guān)鍵是要構(gòu)建一種啟動(dòng)子探針載體。探針型載體是一種有效、經(jīng)濟(jì)、快速分離基因啟動(dòng)子的工具型載體，包含2個(gè)基本部分：轉(zhuǎn)化單元和檢測(cè)單元。其中，轉(zhuǎn)化單元含復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因，用于選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；檢測(cè)單元?jiǎng)t包括1個(gè)已失去轉(zhuǎn)錄功能且易于檢測(cè)的遺傳標(biāo)記基因以及克隆位點(diǎn)。

利用啟動(dòng)子探針載體篩選啟動(dòng)子的過(guò)程為，先選用1種適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶消化切割染色體DNA，然后將切割產(chǎn)生的DNA限制片段群體與無(wú)啟動(dòng)子的探針質(zhì)粒載體重組，并按照設(shè)計(jì)的要求使克隆的片段恰好插在緊鄰報(bào)告基因的上游位置；隨后再把重組混合物轉(zhuǎn)化給寄主細(xì)胞，構(gòu)建質(zhì)粒載體基因文庫(kù)，并檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)活性。

最早由Rachael等在大腸桿菌中以四環(huán)素抗性基因作為報(bào)告基因構(gòu)建了啟動(dòng)子探針質(zhì)粒pBRH3B，并克隆了一些原核和真核啟動(dòng)子片段。其后Donna等以氯霉素抗性基因作為報(bào)告基因，F(xiàn)odor等以大腸桿菌LacZ為報(bào)告基因，構(gòu)建了酵母啟動(dòng)子探針質(zhì)粒并克隆了一些啟動(dòng)子片段。張曉寧等用啟動(dòng)子探針載體pECE7克隆了鹽藻耐鹽基因的啟動(dòng)子[10-13]。

該方法不需要知道具體基因的序列，可隨機(jī)篩選啟動(dòng)子，避免了引物設(shè)計(jì)，能獲得大量的啟動(dòng)子片段。

1.6 利用載體或接頭的染色體步行技術(shù)克隆基因啟動(dòng)子

該方法首先要提取基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶消化，產(chǎn)生出適合于克隆的DNA片段，然后在體外將這些DNA片段同適當(dāng)?shù)摩耸删w載體連接成重組體分子，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的受體細(xì)胞中，構(gòu)建基因組文庫(kù)。將構(gòu)建好的基因組文庫(kù)鋪板，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用部分已知序列的片段或特異的基因片段做探針進(jìn)行雜交，篩選出具有目的啟動(dòng)子的克隆，測(cè)序分析即可獲得該啟動(dòng)子。

王新國(guó)等利用銜接頭的方法[14]，設(shè)計(jì)了位于單鏈DNA兩端互補(bǔ)的顛倒末端重復(fù)序列，增加了反應(yīng)的特異性，在胡蘿卜II型轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子的克隆方面取得了新的進(jìn)展。

這種方法具有便于操作、試驗(yàn)線路簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但是特異性較差，產(chǎn)物需進(jìn)一步雜交驗(yàn)證。

1.7 YADE法

Prashar等在擴(kuò)增cDNA 3'端時(shí)采用“Y”形接頭，以減少接頭引物的單引物擴(kuò)增[15]。

其原理是接頭引物處于“Y”接頭的2個(gè)分叉單鏈上，序列與接頭一樣，只有與特異引物引導(dǎo)合成了接頭的互補(bǔ)序列后，接頭引物才能退火參與擴(kuò)增（見(jiàn)圖 4）。

圖4 YADE法的流程Fig.4 Schemtic diagram of YADE

方衛(wèi)國(guó)等嘗試將YADE法引入到昆蟲(chóng)病原真菌的分子生物學(xué)研究[16]。在已克隆的類球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1的基礎(chǔ)上，利用YADE法，克隆到該基因的啟動(dòng)子CDEPP。過(guò)程是先酶切球孢白僵菌基因組DNA，然后與“Y”形接頭相連，取連接產(chǎn)物做模板，先以基因特異引物1做線性擴(kuò)增，再以線性擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以接頭引物和基因特異引物2做指數(shù)擴(kuò)增，只有當(dāng)線性擴(kuò)增時(shí)合成了含有接頭引物的互補(bǔ)單鏈，接頭引物才能與其發(fā)生退火，參與指數(shù)擴(kuò)增，從而有效防止了接頭引物的單引物擴(kuò)增。最后得PCR產(chǎn)物，進(jìn)行序列分析確定為CDEP-1的上游啟動(dòng)子序列。

在應(yīng)用YADE法時(shí)，內(nèi)切酶的選擇至關(guān)重要。好的內(nèi)切酶產(chǎn)生適合PCR擴(kuò)增的片段，太大太小都不行。為了得到合適的內(nèi)切酶，需要從眾多的內(nèi)切酶中篩選。研究表明，不同的物種有自己合適的內(nèi)切酶。YADE法延伸的起始片段可以是基因組DNA片段，也可以是cDNA片段，在延伸cDNA片段時(shí)，設(shè)計(jì)的引物需要避開(kāi)內(nèi)含子和外顯子的邊界，在內(nèi)含子的位置未知的情況下，可考慮多合成1～2條特異引物，以提高擴(kuò)增未知片段的機(jī)率。該方法假陽(yáng)性低、效率高，理論上能擴(kuò)出所有目的片段。

1.8 接頭PCR技術(shù)

接頭PCR是繼I-PCR方法之后的又一用來(lái)擴(kuò)增基因組中已知序列兩側(cè)未知序列的方法。當(dāng)基因序列已知，要克隆此基因啟動(dòng)子時(shí)即可使用此方法，其原理如下：首先，用幾種限制性內(nèi)切酶酶切DNA，然后將酶切后的DNA與體外合成的接頭在適當(dāng)?shù)臈l件下連接，取適量連接產(chǎn)物直接作為PCR模板，其中一條引物為接頭特異引物，其序列能與接頭序列互補(bǔ)；另一條引物為基因特異引物，其序列與已知序列互補(bǔ)，該引物3'端朝向要擴(kuò)增的序列區(qū)。最后將PCR產(chǎn)物克隆并測(cè)序。

在這種方法中，有一個(gè)特殊的接頭，該接頭由一條長(zhǎng)鏈和短鏈組成，短鏈接頭的3'端有一個(gè)NH2的存在，它能阻斷短接頭鏈的酶促延伸，而且只有當(dāng)一條遠(yuǎn)端的基因特異引物相對(duì)長(zhǎng)鏈接頭方向延伸一條DNA鏈后，才能產(chǎn)生引物結(jié)合位點(diǎn)。如果產(chǎn)生了兩末端都含有雙鏈接頭序列的PCR產(chǎn)物（非特異性PCR產(chǎn)物），由于反向重復(fù)序列的存在，在緊接著的每步變性過(guò)程中DNA鏈的末端會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)比引物與模板的雜交鏈更穩(wěn)定，因此會(huì)抑制指數(shù)式擴(kuò)增。然后，當(dāng)一個(gè)遠(yuǎn)端的基因特異性引物通過(guò)接頭延伸一條DNA鏈，延伸產(chǎn)物將只有一端會(huì)有接頭序列，這樣就不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，PCR擴(kuò)增能正常進(jìn)行。

王新國(guó)等利用這種特殊的接頭設(shè)計(jì)了位于單鏈DNA兩端互補(bǔ)的顛倒末端重復(fù)序列，一條長(zhǎng)鏈接頭序列和一條短鏈接頭序列，增加了反應(yīng)的特異性，在胡蘿卜Ⅱ型轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子的克隆方面取得了新的進(jìn)展[14]。根據(jù)接頭PCR的原理，TaKaRa公司推出了LA-PCR體外克隆試劑盒（DDR015）。用來(lái)克隆基因側(cè)翼未知序列。Miao用試劑盒克隆了小麥淀粉合成酶基因gbss的啟動(dòng)子序列。Li等也用LA-PCR試劑盒的方法，首次分離了長(zhǎng)度為1 216 bp的山葡萄幾丁質(zhì)酶基因VCH3上游啟動(dòng)子序列[17-18]。

1.9 TAlL-PCR技術(shù)

熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR，簡(jiǎn)稱TAIL-PCR）是一種用來(lái)分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)由Liu和Whitter首先研究并報(bào)道。在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中，利用該技術(shù)分離出的DNA序列可以用于圖位克隆、遺傳圖譜繪制的探針，也可以直接測(cè)序[19-20]。

TAIL-PCR技術(shù)的基本原理是利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物（specialprime，簡(jiǎn)稱sp1，sp2，sp3，約20 bp），用它們分別和1個(gè)具有低Tm值的短的（14 bp）隨機(jī)簡(jiǎn)并引物（Arbitrary Degenerate Prime，ADP）相組合，以基因組DNA作為模板，根據(jù)引物的長(zhǎng)短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對(duì)稱的溫度循環(huán)，通過(guò)分級(jí)反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增特異引物。反應(yīng)流程如圖5所示。由一個(gè)特異性引物和一個(gè)簡(jiǎn)并引物組合構(gòu)成的PCR反應(yīng)叫做“半特異性PCR”。這種反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生3種不同類型的產(chǎn)物：①由特異性引物和簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物；②由同一特異性引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物；③由同一簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物。在TAIL-PCR反應(yīng)中，后兩種非目標(biāo)產(chǎn)物可以通過(guò)以嵌套的特異性引物進(jìn)行的后續(xù)反應(yīng)來(lái)消除。

圖5 TAIL-PCR反應(yīng)流程Fig.5 Protocol of TAIL-PCR

TAIL-PCR反應(yīng)的條件在不同的試驗(yàn)中稍有變化。在表1所示的條件下對(duì)P1和YAC克隆插入末端序列的分析中獲得了滿意的結(jié)果。這種反應(yīng)條件亦是一個(gè)規(guī)范的試驗(yàn)設(shè)置，可以滿足大多數(shù)試驗(yàn)的需要。反應(yīng)體系中，特異性引物的濃度與普通的PCR相同，簡(jiǎn)并引物的濃度要高，一般為2.5～5 μmol·L-1，以滿足引物的結(jié)合效率。（簡(jiǎn)并引物AD1：TGWGNAGWANCASAGA；AD2：CAWCGIC NGAIASGAA；AD3：TCSTICGNACITWGGA；AD4：NTCGASTWTSGWGTT；AD5：NGTCGASWGANAW GAA；AD6：WGTGNAGWANCANAGA；AD7：AG WGNAGWA NCAWAGG；D=G，A，T；M=A，C；N=A，G，C，T；R=A，G；S=G，C W=A，T）。

目前已成功地從P1、YAC和BAC克隆中分離獲得插入末端的DNA序列，如表1的T-DNA側(cè)翼序列。此外，經(jīng)過(guò)改良的TAIL-PCR技術(shù)能夠快速克隆Pal及Pgi基因的啟動(dòng)子序列和野油菜黃單胞菌群體感應(yīng)信號(hào)基因。

TAIL-PCR技術(shù)能夠快速地分離到目標(biāo)序列，對(duì)基因克隆研究具有重要的意義。TAIL-PCR技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)：①簡(jiǎn)單。只要設(shè)計(jì)好引物，即可以用基因組DNA作模板直接篩選到目標(biāo)序列，節(jié)省了PCR反應(yīng)前后的許多費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的操作程序。②特異性高。用短的簡(jiǎn)并引物和長(zhǎng)的特異性嵌套引物相組合，通過(guò)不對(duì)稱的溫度循環(huán)和分級(jí)反應(yīng)，使反應(yīng)體系有利于特異引物的擴(kuò)增，最終的擴(kuò)增產(chǎn)物中目的片段占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，反應(yīng)產(chǎn)物可以直接用做探針標(biāo)記和測(cè)序模板。③高效靈敏。使用任何一個(gè)AD引物，在60%～80%的反應(yīng)中能夠產(chǎn)生特異性產(chǎn)物。運(yùn)用不同的AD引物就能夠有效地?cái)U(kuò)增到目標(biāo)片段。④快速。整個(gè)TAIL-PCR反應(yīng)循環(huán)能夠在1 d內(nèi)完成，可以快速地獲得目標(biāo)片段。⑤不涉及連接反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好。

2 啟動(dòng)子克隆方法比較

以上介紹的幾種方法基本代表了現(xiàn)有的啟動(dòng)子克隆方法，它們分別具有不同的特點(diǎn)和適用范圍，見(jiàn)表2。

表1 TAIL-PCR反應(yīng)分離P1和YAC克隆的插入末端序列Table 1 Cycling conditions used for TAIL-PCR of P1and YAC clone

表2 啟動(dòng)子克隆方法比較Table 2 Comparison of promoter clone methods

3 展望

目前，啟動(dòng)子克隆的方法種類繁多，進(jìn)展迅速。啟動(dòng)子克隆方法絕大多數(shù)是建立在PCR的基礎(chǔ)上的染色體步行技術(shù)，因而利用啟動(dòng)子克隆的方法不僅可以克隆到基因的啟動(dòng)子，同時(shí)還可以用于克隆cDNA的全長(zhǎng)。另外，隨著基因工程的發(fā)展，出現(xiàn)了越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物，啟動(dòng)子克隆的方法也可以應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因生物的研究中，如轉(zhuǎn)基因水稻的T-DNA區(qū)，通過(guò)啟動(dòng)子克隆方法的PCR步行技術(shù)，能成功地克隆到T-DNA區(qū)的旁側(cè)序列，有助于分析突變體中突變區(qū)序列。

隨著PCR技術(shù)的不斷進(jìn)步，一定會(huì)有更多、更好的克隆啟動(dòng)子的方法產(chǎn)生，而它們最后也將會(huì)是克隆基因全長(zhǎng)或突變體（特別是轉(zhuǎn)座子插入突變體）中目的基因的簡(jiǎn)便、高效的新方法。

[1]Wang L J,Fan S H,Guo A G.Cloning and functioanalysis of ats1A gene promoter from Arabidopsis thaliana[J].Acta Botanica Boreali-Occidentali Sinica,2004,4(10):1856-1860.

[2]蘇寧,孫萌,李軼女,等.水稻葉綠體16S啟動(dòng)子克隆改造、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化研究[J].植物學(xué)通報(bào),2003,20(3):295-301.

[3]TrigliaT,PetersoMG,KempDJ.AProcedurefor in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences[J].Nuclic Acids Res,1988,16:8186-8186.

[4]ForesterC,ArthurE,CrespiS,etal.Isolationofapea(Pisumsativum)seed lipoxygenase promoter by inverse polymerase chain reaction and characterization of its expression in transgenic tobacco[J].Plant Mol Biol,1994,26(1):235-248.

[5]韓志勇,王新其,沈革志,等.反向PCR克隆轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因旁側(cè)序列[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2001,17(2):27-32.

[6]Jones D.Panhandle PCR[J].PCR Meth Appl,1995,4:S195.

[7]黃君健,李杰之,林堅(jiān),等.人端粒酶催化亞基hTERT基因啟動(dòng)子的克隆[J].生物技術(shù)通訊,1999,10(3):36-39.

[8]Huang S H,Jong A Y,Yang W,et al.Amplification of gene ends from gene library by PCR with single-sided specificity[J].Methods Mol Biol,1993,15:357-363.

[9]范云,劉兵,王宏斌,等.胡蘿卜抗凍蛋白基因的克隆及其在E.coli中的表達(dá)[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào),2002(3):26-29.

[10]Rachael L N,Robert W W,Raymond L R.Eukaryotic DNA fragments which act as promoters for a plasmid gene[J].Nature,1979,277:324-325.

[11]DonnaMW,ElizabethJD,PaulSL.Cloningrestrictionfragmentsthat promoteexpression of a gene in Bacillus subtilis[J].J Bacterol,1981,146:1162-1165.

[12]FordorI,KranikovaOV,BeretsE,etal.Cloningstructureandfeatures of a Saccharomyces cerevisiae DNAfragment causing the expression of reportergenes[J].Mol Biol,1990,24:1411-1418.

[13]張曉寧.鹽藻耐鹽相關(guān)基因的克隆、功能分析與高效啟動(dòng)子的分離鑒定[D].上海:復(fù)旦大學(xué),2002:53-67.

[14]王新國(guó),張國(guó)華.用銜接頭PCR克隆新的胡蘿卜Ⅱ型轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子[J].中國(guó)生物學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2001,17(1):61-65.

[15]Prarshar Y,Weissman S M.the cloning of halotoler ant correlative gene,functionanalyse[J].ProcNatlAcadSciUSA,1996,93:659-663.

[16]方衛(wèi)國(guó).用YADE法克隆球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1的啟動(dòng)子及啟動(dòng)子序列分析[J].菌物系統(tǒng),2003,22(2):252-258.

[17]Miao H M.Cloning and characterization of the promoters of key starch synthesis enzyme genes in wheat[J].2004,85:57-68.

[18]Li H Y,Qi J,Shu H R,et al.Isolation and characterization of a chitinase gene VCH3promoter from grapevine[J].Plant Physiol Mol Biol,2005,31(5):485-491.

[19]Liu Y G,Robert F W.Thermal asymmetric interlaced PCR:automatable amplification and sequencing of insert end fragment from P1and YAC clones for chromosome walking[J].Genomics,1995,25:674-681.

[20]Liu Y G.Huang Ning Efficient amplification of insert end sequences from bacterial artificial chromosome clones by thermal asymmetric interlaced PCR[J].Plant Molecular Biology Reporter,1998,16(2):175-181.