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    加壓素在妊娠期高血壓疾病大鼠下丘腦視上核和室旁核內(nèi)的表達(dá)

    2010-06-30 04:14:58孫惟靖于紅任慕蘭張露青
    當(dāng)代醫(yī)學(xué) 2010年31期
    關(guān)鍵詞:胎鼠加壓素陽性細(xì)胞

    孫惟靖 于紅 任慕蘭 張露青

    妊娠期高血壓疾病(Hypertensive disorders in pregnancy)是妊娠期特有的疾病,是孕產(chǎn)婦及圍生兒死亡的重要原因之一。妊娠期高血壓疾病的基本病理生理改變?yōu)槿硇用}痙攣,引起外周循環(huán)阻力增加、血壓升高[1]。妊娠期高血壓疾病病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制迄今尚不完全清楚,多認(rèn)為可能與子宮胎盤供血不足、免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌因素有關(guān)[2]。

    有研究表明妊娠期高血壓疾病時,內(nèi)皮細(xì)胞受損,加壓素(vasopression,VP)、血管緊張素Ⅱ、腎上腺素、胰島素等傳遞介質(zhì)被激活,調(diào)節(jié)內(nèi)皮因子的釋放[3]。VP由下丘腦產(chǎn)生,經(jīng)纖維投射至垂體后葉釋放,參與體液調(diào)節(jié)以及心血管系統(tǒng)、腺垂體的功能調(diào)節(jié),并與痛覺的調(diào)制有關(guān)。妊娠期高血壓疾病能導(dǎo)致多系統(tǒng)并發(fā)癥[4-5,7],然而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變化,尤其是心血管中樞的改變卻鮮有報道。本實驗利用亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)建立妊娠期高血壓疾病模型,研究在妊娠期高血壓疾病病理生理過程中母體腦內(nèi)的心血管調(diào)節(jié)核團(tuán)下丘腦視上核(SON)、室旁核(PVN)內(nèi)加壓素(VP)含量的變化。為進(jìn)一步研究中樞對心血管活動的調(diào)節(jié)機(jī)制,以及VP在妊娠期高血壓疾病的發(fā)病過程中的作用提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物及妊娠期高血壓疾病動物模型的制備 用L-NAME(江蘇省南通碧云天生物技術(shù)研究所)阻斷一氧化氮(NO)合成可使孕鼠產(chǎn)生妊娠期高血壓疾病特征及相應(yīng)的病理生理改變,本研究采用此方法制備妊娠期高血壓疾病動物模型[6-8]。10周齡SD雌性大鼠12只(中國科學(xué)院上海實驗動物中心),(180±10)g,在相同環(huán)境下用正常飼料喂養(yǎng)。按雌雄2∶1合籠,次日根據(jù)陰道涂片鏡檢,以發(fā)現(xiàn)精子作為妊娠第1天。受孕后隨機(jī)分為兩組,每組6只。(1)模型組:從孕13d至分娩每日皮下注射L-NAME 250mg/kg;(2)正常妊娠組,從孕13d至分娩每日皮下注射生理鹽水。另取6只未孕雌鼠作為對照組。血壓測量:室溫20℃,3組大鼠在清醒狀態(tài)下,于每日上午9時用尾筒法測定尾動脈收縮壓和舒張壓,直至分娩。計算平均動脈壓,取其平均值(舒張壓+1/3脈壓)。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。尿蛋白測定:分別于妊娠第12~20天用標(biāo)準(zhǔn)代謝籠收集孕鼠24h尿量,以考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法[8]測定尿蛋白濃度。仔鼠測量:剖宮取仔,記錄胎鼠數(shù), 測胎鼠體重。行為觀察:初步觀察孕晚期孕鼠的行為是否異常,如行動減少、反應(yīng)遲緩、目光呆滯、面部抽搐等。

    表1 各組大鼠平均動脈壓、尿蛋白含量和胎鼠體重(±s)

    表1 各組大鼠平均動脈壓、尿蛋白含量和胎鼠體重(±s)

    注:與正常妊娠組和對照組比較*P<0.05;與正常妊娠組比較#P<0.05

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    表2 各組大鼠SON和PVN內(nèi)VP陽性神經(jīng)元數(shù)目(±s)

    表2 各組大鼠SON和PVN內(nèi)VP陽性神經(jīng)元數(shù)目(±s)

    注:與正常妊娠組和對照組比較*P<0.05;與正常妊娠組和對照組比較#P>0.05

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    圖A SON主部VP免疫陽性神經(jīng)元的分布(ABC免疫組化染色,×200)。標(biāo)尺=80μm圖B SON尾部AVP免疫陽性神經(jīng)元的分布(ABC免疫組化染色,×200)。標(biāo)尺=80μm圖C PVM亞核內(nèi)VP免疫陽性細(xì)胞的分布(ABC免疫組化染色,×200)。標(biāo)尺=80μm圖D PVL亞核內(nèi)VP免疫陽性細(xì)胞的分布(ABC免疫組化染色,×200)。標(biāo)尺=80μm

    1.2 取材與切片 于妊娠21d戊巴比妥鈉麻醉下,剪開胸腔,將穿刺針自心尖處進(jìn)針,刺入升主動脈,用小止血鉗鉗夾固定,剪開右心耳,先用生理鹽水250mL快速灌注至肝臟就成灰白色,再用4%中性多聚甲醛溶液200mL灌注固定。灌注固定后取鼠腦,置4%多聚甲醛固定48h,再依次用20%、30%的蔗糖溶液脫水。取材將含SON和PVN的組織塊在冰凍切片機(jī)中作連續(xù)冠狀切片(厚30μm)。

    1.3 免疫組織化學(xué)染色 切片經(jīng)正常羊血清(l∶50)處理30min,兔抗VP血清(l∶5000,美國Chemicon公司)4℃孵育12h,PBS漂洗,ABC免疫反應(yīng),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液(0.05 ∶0.01%,北京中山生物技術(shù)有限公司)室溫孵育約15min,PBS漂洗終止反應(yīng)。對上述切片脫水封片,光鏡觀察、攝片、并在高倍鏡下計數(shù)。

    1.4 細(xì)胞計數(shù)和統(tǒng)計學(xué)方法 采用Leica LAS圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)分析。實驗數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,統(tǒng)計結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,顯著性水平設(shè)為α=0.05。

    1.5 對照實驗 另取1只SD鼠腦冠狀連續(xù)切片,分2套分別作如下對照試驗:①空白試驗:省去免疫組化染色中兔抗VP血清,孵育切片。②置換試驗:用正常兔血清代替VP免疫組織化學(xué)染色中的兔抗VP血清。

    2 結(jié)果

    2.1 妊娠期高血壓疾病指標(biāo)的測定 妊娠期高血壓疾病大鼠出現(xiàn)行動減少、反應(yīng)遲緩等異常行為,同時出現(xiàn)血壓、尿蛋白升高,胎鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩等一系列病理學(xué)變化,與人類妊娠期高血壓疾病的癥狀相似。妊娠期高血壓疾病組平均動脈壓為明顯高于對照組和正常妊娠組(P<0.05)。給藥組孕鼠尿蛋白濃度顯著增加(表1,P<0.05),胎鼠體重降低(P<0.05)。見表1。

    2.2 對照實驗結(jié)果 空白試驗和置換實驗均不出現(xiàn)相應(yīng)的陽性反應(yīng)結(jié)果,表明本實驗無抗體交叉反應(yīng)存在。

    2.3 SON內(nèi)VP陽性神經(jīng)元的形態(tài)與分布 光鏡下SON細(xì)胞群密集分布于大腦底部視交叉(OC)上方的兩側(cè)。核團(tuán)呈三角形,頂尖向內(nèi)側(cè)傾斜。鏡下妊娠期高血壓疾病組和對照組大鼠的SON可見VP陽性細(xì)胞群。SON主部(SONm)VP陽性神經(jīng)元分布較為密集,呈內(nèi)側(cè)稍寬的帶狀分布于OC的外上方(圖A)。SON尾部(SONr)的陽性細(xì)胞沿下丘腦邊緣排列,細(xì)胞長軸大多一致(圖B)。SON內(nèi)的VP免疫陽性神經(jīng)元以大細(xì)胞型為主,神經(jīng)元胞體大,核圓形,核仁清楚,核周有淺染區(qū)。胞質(zhì)內(nèi)可見呈棕黃色的反應(yīng)顆粒,大小不等,散在于胞質(zhì)中。妊娠期高血壓疾病組陽性細(xì)胞數(shù)較對照組和正常妊娠組多(表2,P<0.05)。

    2.4 PV N內(nèi)V P陽性神經(jīng)元的形態(tài)與分布 參照Armstrong[9]對大鼠PVN各亞核的劃分標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合Paxinos和Watson的《The rat brain in stereotaxic coordinates》[10]圖譜,將PVN分為四個大細(xì)胞亞核:前連合核(AC)、內(nèi)側(cè)室旁核(PVM)、外側(cè)室旁核(PVL)、室旁核后亞核(PvPO)。光鏡下可見,兩組大鼠PVN內(nèi)VP免疫陽性神經(jīng)元呈楔形集中分布于第三腦室(3V)兩側(cè)。其中PVM(圖C)和PVL(圖D)亞核細(xì)胞數(shù)目最多。至PvPO水平AVP細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞散在分布于PVL背外側(cè)部。AVP免疫陽性神經(jīng)元以大細(xì)胞型為主,胞體大,以圓形、卵圓形或梭形為主。核圓形,核仁清楚,核周有淺染區(qū)。胞質(zhì)內(nèi)可見呈棕黃色的反應(yīng)顆粒散在于胞質(zhì)中,有的融合成片。免疫陽性神經(jīng)元染色深淺程度不一。細(xì)胞的突起較長。三組大鼠PVN內(nèi)VP陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差異(表2,P>0.05)。

    3 討論

    本實驗應(yīng)用Yallampalli[6]的制模方法建立孕鼠妊娠期高血壓疾病模型,L-NAME抑制NO合成后,孕鼠血壓明顯升高,尿蛋白顯著增加,胎鼠體重降低,胎鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩等一系列變化與人類妊娠期高血壓疾病的癥狀及病理生理變化相似,說明妊娠期高血壓疾病動物模型是成功的,與文獻(xiàn)報道一致[7-8,11]。VP的主要合成部位是SON和PVN。大量的生理學(xué)研究資料[12-13]表明VP、催產(chǎn)素(OT)共同參與血壓、記憶、性行為及生殖功能的調(diào)節(jié)。PVN和SON含有大細(xì)胞神經(jīng)元和小細(xì)胞神經(jīng)元,大部分大細(xì)胞神經(jīng)元的軸突從PVN、SON發(fā)出后,通過視神經(jīng)-垂體通路,輸送到神經(jīng)垂體貯存和釋放。下丘腦視交叉上核(SCN)、PVN、SON的VP神經(jīng)元與腦內(nèi)和心血管調(diào)節(jié)相關(guān)的核團(tuán)如迷走神經(jīng)背核、孤束核(NTS)及脊髓中間外側(cè)角發(fā)生廣泛纖維聯(lián)系,這是參與心血管活動調(diào)節(jié)的解剖學(xué)依據(jù)。研究表明,腦室內(nèi)注射VP可引起潛伏期很短的血壓升高、心率加快。此中樞升壓不伴有尿量的改變,并可被靜脈注射神經(jīng)節(jié)阻斷劑或受體阻斷劑所阻斷??梢娭袠蠽P的變化對心血管有一定的作用,該作用可能是通過激活中樞交感沖動發(fā)放實現(xiàn)的[14]。在中樞,有文獻(xiàn)報道正常大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)下丘腦有VP陽性神經(jīng)元分布[15-16]。張師前等[17]的研究證實妊娠期高血壓疾病患者血漿VP濃度較正常孕婦明顯升高;應(yīng)用降壓藥物治療1~3周后,血漿VP較治療前明顯降低。而對妊娠高血壓狀態(tài)下,腦內(nèi)VP的分布尚缺乏報道。本研究顯示對妊娠期高血壓疾病大鼠的腦內(nèi)心血管核團(tuán)PVN和SON的研究發(fā)現(xiàn):①妊娠期高血壓疾病大鼠的SON和PVN有分泌VP的功能,且細(xì)胞形態(tài)與正常妊娠大鼠相似。②SD孕鼠SON含有的VP較妊娠期高血壓疾病少(P<0.05),提示中樞VP含量的異常增加可能與妊娠高血壓的發(fā)病有關(guān)。③本實驗從形態(tài)學(xué)的角度觀察了三組大鼠的PVN內(nèi)VP免疫陽性細(xì)胞數(shù)目(P>0.05),VP在三組大鼠PVN中表達(dá)的差異有待進(jìn)一步作生化指標(biāo)的測定來驗證。

    妊娠期高血壓疾病的病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,本實驗初步研究了VP在下丘腦心血管核團(tuán)中的表達(dá)情況,為進(jìn)一步從蛋白和分子水平上探討妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機(jī)制和VP的作用提供形態(tài)學(xué)資料。

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