鹿茸方對糖尿病腎病大鼠TIMP-1m RNA表達(dá)的調(diào)節(jié)

王好杰,張 潔,葉偉成,倪培華

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)患者常見的并發(fā)癥之一,是導(dǎo)致終末期腎衰竭(ESRD)的重要原因。據(jù)美國DM協(xié)會統(tǒng)計,DN已經(jīng)成為ESRD的主要原因。因此尋找防治DN的有效藥物已成為全球DM界所共同關(guān)注的重點課題之一。既往在用鹿茸方治療DN中,臨床觀察和動物實驗均證明,臨床總有效率達(dá)89.47%,能有效降低DN患者及鏈脲菌素(STZ)DN模型大鼠的尿微量白蛋白排泄率(UAER),調(diào)節(jié)一氧化氮和內(nèi)皮素代謝,下調(diào)DN大鼠腎臟醛糖還原酶(AR)m RNA的表達(dá),下調(diào)腎皮質(zhì)TGF-β1m RNA的表達(dá)。同時既往運用基因芯片對DN模型大鼠腎組織部分基因表達(dá)篩選的研究結(jié)果表明,DN模型大鼠的腎皮質(zhì)組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(Tissue Inhibitor of Metallop roteinase-1,TIMP-1)m RNA表達(dá)明顯上調(diào),提示與DN的發(fā)生發(fā)展有著一定的關(guān)系。本課題在鹿茸方既往研究基礎(chǔ)上,運用鏈脲菌素誘導(dǎo)的DN大鼠模型結(jié)合鹿茸方的干預(yù)治療,來觀察鹿茸方對腎皮質(zhì)TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響,在分子水平上探討鹿茸方防治DN的可能療效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠45只(由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供),體重180 g～200 g。

1.2 實驗藥物 鹿茸方由菟絲子、鹿角片、肉蓯蓉、生地黃、補(bǔ)骨脂、懷牛膝、益母草、黃芪組成,為水煎后濃縮藥液,相當(dāng)于3 g/m L。水飛薊賓片(益肝靈片)由上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司提供,每片38.5mg。

1.3 實驗試劑及儀器 OTRIzol試劑(GIBco BRL公司);PCR Marker DL2000 M arker(Takara公司);STZ(Sigma公司)。高速低溫離心機(jī);-80℃冰箱;紫外分光光度計UV1240;DYNEX OPSYSMR酶標(biāo)儀;PTC 200 DNA擴(kuò)增儀;雅培全自動生化分析儀;電泳儀;凝膠成像系統(tǒng);引物序列:TIM P-1上游引物P1 5'TCCCCAGAAATCATCGAGAC 3',下游引物P 2 P 2 5'TGGCTGAACAGGGAAACACT3',產(chǎn)物長度328bp,Beta-actin上游引物P1 5'GGCATCCTGACCCTGAAGTA 3',下游引物P2 5'AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG3',產(chǎn)物長度614bp。RTPCR檢測所檢測的基因及內(nèi)參照β-ac tin引物序列由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 DN造模及分組 健康雄性W istar大鼠45只,取40只大鼠腹腔注射STZ(45mg/kg,溶解在0.1mol/L滅菌枸櫞酸鈉緩沖液中,pH=4.0),另外5只僅注射等量的上述滅菌枸櫞酸鈉緩沖液。4周后用金屬代謝籠收集大鼠24 h尿液,測定UAER,在(30～300)mg/24 h者視為DN造模成功。

將造模成功者33只隨機(jī)分為4組,模型組9只,鹿茸方小劑量治療組8只,鹿茸方中劑量治療組8只,水飛薊賓治療組8只。另設(shè)僅注射上述滅菌枸櫞酸鈉緩沖液大鼠為正常對照組(5只)。

1.5 給藥方法 正常對照組和模型組給予生理鹽水灌胃,每次2 m L,每日1次。鹿茸方小劑量組和中劑量組分別為成人劑量的10倍[(25 g/(kg?d)]、20倍[50 g/(kg?d)]用藥,給予鹿茸方水煎濃縮劑灌胃。水飛薊賓組給予水飛薊賓[38.5mg/(kg?d)]灌胃,1次/日。上述處理用藥8周。

1.6 檢測指標(biāo)和方法

1.6.1 UAER測定 由曙光醫(yī)院檢驗科生化室協(xié)助測定,采用美國雅培ABBOTT-AREOSET全自動生化分析儀測定,試劑為原裝試劑。

1.6.2 腎臟皮質(zhì)TIMP-1 m RNA表達(dá)的測定 組織總RNA的提取。將腎皮質(zhì)組織,放入Eppendorf管中,加TRIzol試劑,200μL氯仿,4℃12 000轉(zhuǎn)離心15 min,加入500μL異丙醇,RNA沉淀中加入1 m L DEPC水配制的75%乙醇。取含有RNA液1μL加100μL DEPC水,用紫外分光光度計定量OD260/OD280,此值在1.8～2.0,提示得到純凈的總RNA。RT-PCR反應(yīng),反轉(zhuǎn)錄體系,DEPC ddH2O 5μL,總RNA 3μg,100 pmoL隨機(jī)六聚體引物1μL,然后加雙蒸水至11μL,65℃10m in,孵育5m in,然后置于冰上順序加入:5×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4μL,1 0mmo/L dNTP 1μL,1 0 0mmol/L DTT 2μL,M-MLV 1μL,RNasin 1μL,37℃60m in,-20℃保存。擴(kuò)增條件包括25μL PCR體系,瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,在紫外燈下觀察結(jié)果并拍照保存。測定其光密度或密度掃描儀對特異性條帶進(jìn)行掃描。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件統(tǒng)計。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠UAER的比較(見表1) 模型組及3個治療組UAER較正常對照組顯著升高(P＜0.05);3個治療組較模型組顯著降低(P＜0.05);水飛薊賓組較鹿茸方小劑量組、鹿茸方中劑量組顯著升高(P＜0.05);小劑量組和中劑量組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠24 h尿量、UAER的比較(±s)

表1 各組大鼠24 h尿量、UAER的比較(±s)

組別尿量(m L)UAER(mg)正常對照組 8.00±2.55 5.73±1.70模型組155.13±27.741)118.70±24.631)鹿茸方小劑量組99.00±38.501)2)3)62.73±18.661)2)3)鹿茸方中劑量組92.40±28.411)2)3)62.16±13.171)2)3)水飛薊賓治療組139.00±27.621)89.20±21.561)2)與正常對照組比較,1)P＜0.05;與模型組比較,2)P＜0.05;與水飛薊治療賓組比較,3)P＜0.05

2.2 各組大鼠腎皮質(zhì)TIMP-1 mRNA表達(dá)比較(見表2) 模型組及3治療組TIMP-1 mRNA表達(dá)較正常對照組顯著升高(P＜0.05);3個治療組TIMP-1mRNA表達(dá)較模型組顯著下調(diào)(P＜0.05);治療組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠腎皮質(zhì)TIMP-1基因表達(dá)的比較(±s)

表2 各組大鼠腎皮質(zhì)TIMP-1基因表達(dá)的比較(±s)

組別TIMP-1正常對照組0.352 0±0.148 3 DN模型組1.360 7±0.274 01)鹿茸方小劑量組0.797 8±0.132 41)2)鹿茸方中劑量組0.654 4±0.075 91)2)水飛薊賓治療組0.766 8±0.381 41)2)與正常組比較,1)P＜0.05;與模型組比較,2)P＜0.05

2.3 各組大鼠腎皮質(zhì)TIMP-1mRNA表達(dá)電泳圖譜(見圖1)

圖1 各組大鼠腎皮質(zhì)TIMP-1基因表達(dá)電泳圖

3 討 論

伴持續(xù)性微量白蛋白尿約80%的1型DM患者和約20%的2型DM患者10年之內(nèi)發(fā)展至臨床DN[1]。A lmdal等[2]觀察發(fā)現(xiàn),伴微量白蛋白尿(30 mg/24 h＜UAER＜300 mg/24 h)的患者在5年內(nèi)有18.6%發(fā)展至臨床DN(UAER≥300 mg),無尿微量白蛋白尿的患者僅有1.8%發(fā)展至臨床DN。因此,在DN的早期積極進(jìn)行干預(yù)治療是非常重要的。DN從第Ⅲ期開始出現(xiàn)典型的糖尿病性腎小球硬化癥,其基本病理改變是腎小球毛細(xì)血管基膜增厚和系膜區(qū)的擴(kuò)張。腎小球ECM積聚是引起腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張、基膜增厚和導(dǎo)致腎小球硬化的主要病理基礎(chǔ)。雖然ECM在腎小球內(nèi)積聚的過程及其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜,但歸納起來則是腎小球內(nèi)ECM合成過程增強(qiáng)或降解過程受到抑制的結(jié)果。腎小球ECM的合成增加和(或)降解減少,打破原有的平衡,引起ECM更新轉(zhuǎn)換失去平衡,導(dǎo)致ECM的過度積聚,進(jìn)而進(jìn)展為腎小球硬化[3]。MMPs/TIMPs系統(tǒng)與ECM的降解關(guān)系密切。MMPs是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能分解纖維類膠原的酶[4,5],MMPs是ECM降解酶系中最重要的一大酶系超家族,MM Ps降解幾乎所有ECM成分。組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)是MMPs的天然特異性抑制劑,是對MMPs的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié),激活后可以與MMPs的活性部位特異性結(jié)合,阻止MMPs與其底物的相互作用,從而降低MMPs的活性,減少ECM的降解,促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展。目前已經(jīng)鑒定的TIM Ps有4種,分別為:TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3及TIMP-4[6]。其中TIMP-1是體內(nèi)存在和作用最廣的一種TIMP,在腎臟主要表達(dá)于腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞,是大多數(shù)MM Ps的抑制物。實驗已經(jīng)證實,腎小球內(nèi)3種固有細(xì)胞特別是系膜細(xì)胞除合成ECM外,在高血糖的誘導(dǎo)下均可合成和分泌TIMPs和MMPs。Wu等[7]STZ制成DM大鼠模型,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,實驗組TIMP-1明顯升高。Phillips等[8]在培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)加入25 mmol/L的葡萄糖24 h后,發(fā)現(xiàn)TIMP-1比對照組增高了8倍,明膠酶活性普遍下降。周巧玲等[9]發(fā)現(xiàn)STZ鼠腎組織TIMP-1表達(dá)明顯上調(diào)。由于高糖等諸多生長因子和細(xì)胞因子的相互作用,最終導(dǎo)致腎組織ECM降解系統(tǒng)尤其是MMPs/TIMPs功能的紊亂,即MMPs活性及m RNA表達(dá)下降,而TIMPs活性及m RNA表達(dá)上調(diào),打破ECM生成和降解之間的平衡,原有的平衡破壞,引起ECM更新轉(zhuǎn)換失去平衡,ECM生成增多降解減少,導(dǎo)致ECM的過度積聚。

根據(jù)中醫(yī)對DM的認(rèn)識,認(rèn)為DM屬中醫(yī)“消渴”范疇。《外臺秘要》引甄立言《古今錄驗方》載“渴而飲水不能多,但腿腫,腳先瘦小,陰痿弱,數(shù)小便者,此是腎消病也”[10]。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院丁學(xué)屏教授積多年臨床經(jīng)驗,認(rèn)為DN病屬“腎消”范疇。消病日久,精微下滲,臟真既虧,陰損及陽,水中無火,氣不化水,因虛致瘀,瘀化為水,泛濫橫溢而為諸癥[11]。謹(jǐn)守病機(jī),治宗陳言《三因極一病證方論》鹿茸方以治[12],該方補(bǔ)腎益氣,滋陰溫陽,疏瘀泄?jié)帷Ｂ菇瞧?補(bǔ)骨脂,肉蓯蓉溫腎壯陽,生地、菟絲子滋腎填精,黃芪益氣補(bǔ)元,升舉清陽,益母草疏瘀泄?jié)?活血利水,懷牛膝引諸藥直達(dá)下焦以為佐使。合而成方,滋化源補(bǔ)陰陽以復(fù)開闔,司其屬令條達(dá)以致和平。在臨床上取得較好療效。鹿茸丸復(fù)方治療DN患者38例總有效率89.47%[13],能顯著降低早期DN患者UAER[14]。鹿茸丸復(fù)方能降低STZDM模型大鼠24h UAER、β2-微球蛋白(β2-MG),調(diào)節(jié)一氧化氮,內(nèi)皮素代謝[15],能顯著降低DM模型大鼠紅細(xì)胞山梨醇,腎臟皮、髓質(zhì)山梨醇,以及下調(diào)模型大鼠腎皮質(zhì)、下調(diào)髓質(zhì)AR基因高表達(dá)[16],顯著下調(diào)糖尿病腎病大鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1的高表達(dá)[17],提示鹿茸方通過多個途徑起到治療糖尿病腎病的作用。

本實驗研究發(fā)現(xiàn),DN模型組大鼠腎皮質(zhì)TIMP-1m RNA較正常大鼠明顯升高,說明DM大鼠內(nèi)環(huán)境的紊亂促進(jìn)了TIMP-1 mRNA的表達(dá),從而抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶的活性,最終導(dǎo)致ECM降解減少,合成增多,促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展。經(jīng)治療后,UAER較DN模型組明顯降低(P＜0.05),提示鹿茸方能通過降低TIMP-1mRNA的表達(dá),恢復(fù)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性,加強(qiáng)ECM降解的作用。這也是鹿茸方發(fā)揮療效的分子機(jī)制之一。本研究對鹿茸方發(fā)揮療效的分子機(jī)制有了新的認(rèn)識,為鹿茸方多靶點發(fā)揮療效提供了分子生物學(xué)依據(jù)。鹿茸方是否還通過其他途徑對DN起到治療作用,尚需要進(jìn)一步研究。

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