柴桂溫膽定志湯對抑郁模型大鼠海馬BDNF和TrκB的影響

陳建，王賀，林久茂，鄭良樸，郝萬山（.福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福建福州5008；.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建福州5008；.北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京0009）

柴桂溫膽定志湯對抑郁模型大鼠海馬BDNF和TrκB的影響

陳建1，王賀1，林久茂2，鄭良樸2，郝萬山3
（1.福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福建福州350108；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建福州350108；3.北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京100029）

目的觀察柴桂溫膽定志湯對抑郁模型大鼠海馬腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）和特異性受體酪氨酸激酶B（TrκB）的影響。方法將42只SD大鼠隨機分為6組，采用長期輕度不可預見性應激加孤養(yǎng)復制大鼠抑郁癥模型，運用免疫組織化學法測定大鼠海馬BDNF及其TrκB的表達。結果模型組大鼠海馬BDNF和TrκB的表達明顯低于空白對照組（P＜0.01）；氟西汀組、柴桂溫膽定志湯高劑量組大鼠海馬BDNF和TrκB的表達皆明顯高于模型組（P＜0.01）；柴桂溫膽定志湯中劑量組大鼠海馬BDNF和TrκB的表達高于模型組（P＜0.05）。結論柴桂溫膽定志湯能提高抑郁模型大鼠海馬BDNF及其受體TrκB的表達，從而保護海馬神經元，可能是其抗抑郁的藥理機制之一。

抑郁癥；海馬；腦源性神經營養(yǎng)因子；酪氨酸激酶B；柴桂溫膽定志湯

抑郁癥是臨床的疑難病，中西醫(yī)治療都頗為棘手，隨著生活與工作壓力的加大，發(fā)病率有逐漸上升的趨勢。北京中醫(yī)藥大學郝萬山教授在臨床中反復摸索，創(chuàng)立了柴桂溫膽定志湯，用于抑郁癥的治療，取得了良好的效果。筆者在前期研究基礎上，采用長期輕度不可預見性應激加孤養(yǎng)復制抑郁癥大鼠模型，通過觀察大鼠海馬BDNF和TrκB表達的變化，探討柴桂溫膽定志湯對抑郁模型大鼠海馬神經元的影響，以期闡釋該方的抗抑郁機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物鹽酸氟西汀膠囊［20 mg／片，Patheon France（法國），批號：8147A］。柴桂溫膽定志湯組成：柴胡10 g，黃芩10 g，桂枝10 g，赤芍10 g，白芍10 g，半夏10 g，生姜10 g，陳皮10 g，枳殼10 g，竹茹10 g，茯苓20 g，人參5 g，石菖蒲6 g，遠志10 g，大棗5枚，炙甘草6 g。中藥飲片由福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂提供。

1.1.2 試劑多聚賴氨酸；BDNF抗體（美國SANTACRUZ公司，批號：B0626）；TrκB抗體（美國SANTA CRUZ公司，批號：D0809）；SP試劑盒（河北博海生物工程開發(fā)有限公司，批號：701323A）；DAB染色試劑盒（河北博海生物工程開發(fā)有限公司，批號：673767A）等。

1.1.3 實驗動物清潔級成年SD大鼠42只，雌雄各半，體重（200±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物合格證號：0054756。

1.1.4 主要儀器顯微鏡（日本奧林巴斯，BX51TPHD-J11）；多功能真彩色細胞圖象分析管理系統（美國Media Cybernetics公司，Image-Pro Plus）；切片機（德國萊卡，RM2015）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組大鼠購進后，適應性飼養(yǎng)1周，隨機分為6組，每組7只，即正常對照組（NC組）、模型對照組（MC組）、氟西汀組（FC組）、柴桂溫膽定志湯高劑量組（CG組）、柴桂溫膽定志湯中劑量組（CZ組）、柴桂溫膽定志湯低劑量組（CD組）。

1.2.2 造模參照文獻［1］，空白組自由飲水攝食，不予任何刺激。其余各組大鼠1只／籠，孤養(yǎng)。自分組之日起，連續(xù)給予21 d各種未預知的應激，包括24 h禁食，24 h禁水，通宵照明，4℃冷水游泳5 min，40℃烘箱熱烘5min，夾尾1min，100伏電擊足底1min，懸尾1 min等刺激。每日從以上的刺激中隨機選擇1種，順序隨機，使動物不能預知給予的刺激，制備抑郁癥大鼠模型。

1.2.3 給藥氟西汀以蒸餾水配制成濃度為0.18 mg／mL的藥液；柴桂溫膽定志湯分別以蒸餾水配置成3.156，1.578，0.789 g／mL高、中、低3種濃度的藥液，備用。每組動物于每日上午9：30灌胃，正常對照組和模型對照組每次分別灌服生理鹽水10mL／kg；氟西汀組灌服氟西汀藥液10mL／kg；中藥各劑量組分別灌服相應濃度藥液10 mL／kg。人與大鼠用藥量換算參考文獻方法［2］，各組灌藥量均為70 kg成人的等效劑量。在給予應激的第1 d開始灌胃，連續(xù)21 d，每日1次。

1.2.4 取材6組大鼠于實驗結束的第2 d斷頭處死，大鼠麻醉后開胸，升主動脈插管，生理鹽水沖洗后，繼續(xù)灌注4%多聚甲醛，取腦后固定，蔗糖內梯度脫水，浸蠟，石蠟包埋，切片，取海馬與齒狀回互包平面，切片厚度5μm。

1.2.5 免疫組織化學法測定大鼠海馬BNDF、TrκB的表達情況將組織切片附于經多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜；常規(guī)脫蠟至水；1%甲醇雙氧水，室溫10min，蒸餾水洗1次，0.1MPBS洗3次×5 min；切片上滴加抗原修復液，室溫10 min，0.1MPBS洗3次，5min；切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min。甩去多余液體，不洗。切片上滴加第一抗體，4℃過夜，0.1 MPBS洗3次，5min。切片上滴加生物素化第二抗體（IgG），37℃20min，0.1MPBS洗3次，5 min；切片上滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A／HRP），37℃20min，0.1MPBS洗3次，5 min；DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，加至標本上，顯色6 min，充分水洗；蘇木素輕度復染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察并拍片。

1.2.6 免疫組織化學染色半定量分析采用Image Pro Plus多功能真彩色細胞圖象分析管理系統，對照大鼠腦立體定位圖譜，選擇實驗組和對照組的陽性和陰性組織相。每張切片選擇5個互不重疊的視野，在400倍光鏡下分別測量各個視野的BDNF和TrκB陽性細胞數，用單位面積陽性細胞記數和總細胞數的百分比表示該成分的相對含量，取其平均值。

1.3 統計學分析使用SPSS 13.0軟件包對數據進行統計分析，所有數據均用均數±標準差（ˉx±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

實驗結果見表1，圖1，圖2。

表1 各組大鼠海馬BDNF和TrκB相對含量比較（ˉx±s）

2.1 對大鼠海馬BDNF表達的影響光鏡下可見BDNF和TrκB免疫組織化學陽性細胞在海馬區(qū)主要集中干CA1和CA3區(qū)錐體細胞和DG顆粒細胞，二者的陽性反應存在于細胞胞漿中，胞核不染色。與NC組相比，MC組大鼠海馬的BDNF免疫反應陽性神經元數目明顯減少，有顯著意義（P＜0.01）；與MC組相比，FC組大鼠海馬的BDNF免疫反應陽性神經元數目明顯增加，有顯著意義（P＜0.01），CG、CZ組大鼠海馬的BDNF免疫反應陽性神經元數目明顯增加，有統計學意義（P＜0.01、P＜0.05）；CG組與FC組相比較，無統計學意義；中藥高、中劑量組相比較，無統計學意義。

2.2 對大鼠海馬TrκB表達的影響結果顯示，與NC組比較，MC組大鼠海馬TrκB免疫反應陽性神經元數目明顯減少，有顯著意義（P＜0.01）；與MC組相比，FC組大鼠海馬的TrκB免疫反應陽性神經元數目明顯增加，有顯著意義（P＜0.01），CZ、CG組大鼠海馬的TrκB免疫反應陽性神經元數目明顯增加，有統計學意義（P＜0.05、P＜0.01）；CG組與FC組相比較，無統計學意義；中藥高、中劑量組相比較，無統計學意義。

圖1 各組大鼠海馬BDNF免疫組化染色

圖2 各組大鼠海馬TrκB免疫組化染色

3 討論

抑郁癥的病人往往有情緒低落、興趣減低、思維遲鈍、乏力等癥狀。臨床觀察到，病人乏力的癥狀往往有晨重暮輕的特點，與少陽病的發(fā)病特點頗相吻合。少陽為“小陽”，屬木行，其陽氣生發(fā)于清晨。若少陽陽氣不足，生發(fā)無力，則乏力多表現為晨重暮輕；清陽升發(fā)無力，腦竅失充，加之痰濁乘虛上擾，清竅受阻，則思維遲鈍。少陽疏泄失職，情志不暢，則見抑郁、心情低落。可見抑郁癥的病機與膽陽不足、膽失疏泄、痰濁阻竅有關。柴桂溫膽定志湯由經方柴胡桂枝湯、溫膽湯以及《千金要方》中的定志小丸組合而成，有疏肝利膽、溫陽升清、滌痰開竅等功效，用于抑郁癥的治療，效果良好。

長期輕度不可預見性應激加孤養(yǎng)復制的抑郁癥模型能較真實地模擬抑郁癥的某些癥狀和病因，已成為國內外學者探究抑郁癥的發(fā)病機制及抗抑郁劑作用機理而廣泛應用的動物模型。筆者在此模型的基礎上，初步研究柴桂溫膽定志湯的抗抑郁藥理機制。

抑郁癥的發(fā)病機制較為復雜，有研究表明抑郁癥的發(fā)生與海馬區(qū)域神經細胞的萎縮和壞死有關，神經元可塑性失調與抑郁癥的發(fā)病關系密切［3］。BDNF是神經營養(yǎng)因子家族中的重要成員，是一種具有防止神經元死亡功能的蛋白質，其表達水平的下降參與抑郁癥的某些生理、病理過程，可能是抑郁癥的基本病理改變之一。TrκB是BDNF特異性高親和力受體，廣泛分布于中樞神經系統，對神經元的生存、生長、分化有重要的影響［4］。研究表明通過高親和力受體TrκB介導，BDNF能促進突觸的可塑性，包括增加突觸終末的密度，促進樹突和軸突的長出，直接參與調節(jié)學習和記憶過程［5］?？梢夿DNF／TrκB信號傳導通路在維持神經元細胞的存活、生長及分化等方面發(fā)揮著重要作用［6］。

研究結果顯示，模型組大鼠海馬BDNF和TrκB的表達明顯下降，柴桂溫膽定志湯高、中劑量組不同程度地提高大鼠海馬BDNF和TrκB的表達。表明慢性應激時大鼠海馬BDNF和TrκB的表達降低，BDNF／TrκB信號傳導通路失常是抑郁癥發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)。提高海馬BDNF及其受體TrκB的表達，進而對海馬神經元可塑性進行調節(jié)，保護海馬神經元可能是柴桂溫膽定志湯的抗抑郁藥理機制之一。當然在柴桂溫膽定志湯的抗抑郁過程中，BDNF是如何通過TrκB的介導而達到保護海馬神經元作用的，其深入的機制還有待于進一步研究。

［1］Baker SL，Kentner A C，Koukle A T.Behavioraland physiological effects of chronicmild stress in female rats［J］.Physiol Behavior，2006，87（2）：314-322.

［2］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：103.

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［6］溫文勝，張哲，謝瑩，等.酪氨酸激酶受體B與腦源性神經營養(yǎng)因子mRNA在鼻咽癌中的定量表達［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2009，16（7）：376-379.

R285.5

A

1007－4813（2010）05－0643－03

2010－07－07）

福建省科技廳青年人才資助項目（2007F3044）。

陳建（1974－），男，醫(yī)學博士，副教授。研究方向：經方辨治情志病癥的臨床與實驗研究。