高效液相色譜法測(cè)定血府逐瘀片中赤芍所含芍藥苷的含量

劉立輝（輝南縣人民醫(yī)院，吉林輝南135100）

高效液相色譜法測(cè)定血府逐瘀片中赤芍所含芍藥苷的含量

劉立輝
（輝南縣人民醫(yī)院，吉林輝南135100）

血府逐瘀片；高效液相色譜法；赤芍；芍藥苷；含量

血府逐瘀片是由赤芍、桃仁、當(dāng)歸、川芎等11味中藥組成的復(fù)方制劑，具有活血祛瘀，行氣止痛之功效。主要用于瘀血內(nèi)阻，頭痛或胸痛，內(nèi)熱瞀悶，失眠多夢(mèng)，心悸怔忡，急躁善怒等癥。收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第五冊(cè)59頁(yè)WS3 B－0928 91收載的“血府逐瘀膠囊”，現(xiàn)經(jīng)劑型改革為“血府逐瘀片”，原藥品標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)，為了更好的控制產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定赤芍中芍藥苷的含量，該方法能有效地控制該制劑的質(zhì)量。

1 方法

1.1 儀器與試藥島津SPD-10AVP高效液相色譜儀（日本）；芍藥苷對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)110736-200422，乙腈為色譜純，甲醇為優(yōu)級(jí)純，其它試劑均為分析純。

1.2 色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.05%磷酸溶液（16∶84）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于3 000。

1.3 對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取芍藥苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL中含0.05 mg的溶液。

1.4 供試品溶液的制備取本品1 g，研細(xì)，精密稱(chēng)定，精密加入70%乙醇溶液50 mL，超聲處理（250W，50 KHz）30min，放冷，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸至近干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，加氯仿提取2次，每次25mL，棄去氯仿液，用水飽和正丁醇提取5次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋刻度，搖勻，即得。

2 方法學(xué)考察

2.1 理論板數(shù)的確定按上述方法測(cè)定，得到芍藥苷對(duì)照品及樣品的色譜圖。計(jì)算芍藥苷峰的理論板數(shù)（N）如下：N＝5.54×5.54×（10 241.834。此條件下，芍藥苷與其相鄰的峰分離完全，分離度符合規(guī)定，參考中國(guó)藥典2000年版一部赤芍項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定，暫定其理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)不得低于3 000。

2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇經(jīng)測(cè)定芍藥苷對(duì)照品甲醇溶液的紫外吸收光譜的最大吸收波長(zhǎng)為230 nm，故選取230 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3 流動(dòng)相的選擇試驗(yàn)比較了（1）25%的甲醇溶液和（2）乙腈－0.05%磷酸溶液（16∶84）兩種流動(dòng)相，結(jié)果表明，流動(dòng)相（2）可獲得更好的分離，且保留時(shí)間較短，柱效高。

2.4 脫脂試劑的選擇試驗(yàn)比較了乙醚、氯仿兩種試劑，從色譜圖上看效果都比較好，但氯仿比乙醚脫脂更徹底，故選定氯仿為脫脂試劑。同時(shí)將脫脂后的溶液蒸干，經(jīng)甲醇5mL溶解殘?jiān)?，測(cè)其色譜圖無(wú)芍藥苷峰檢出，故可以認(rèn)定脫脂過(guò)程中，測(cè)定組分基本無(wú)損失。

2.5 氯仿脫脂次數(shù)的考察試驗(yàn)比較了脫脂次數(shù)1，2，3次，結(jié)果2次可以達(dá)較好的脫脂效果，故選取脫脂2次。

2.6 提取方法的考察試驗(yàn)比較了（1）正文方法；（2）甲醇超聲提取30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀芤海螪-101大孔吸附樹(shù)脂柱，水洗50 mL，氨試液2mL洗柱，水洗至中性，再用50%乙醇洗脫，收集洗脫液50mL，蒸干，定容于25mL。結(jié)果方法（1）和（2）測(cè)得的含量基本一致，但方法（1）色譜圖較（2）更清晰。故選定方法（1）為本法的測(cè)定方法。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取芍藥苷對(duì)照品10 mg，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別精密量取上述溶液1，2，5，8，9 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別取10μL注入液相色譜儀中，測(cè)定其峰面積積分值，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝698 923X－216 38，r＝0.999 9，表明芍藥苷進(jìn)樣量在0.4～3.6μg范圍內(nèi)與其峰面積有良好的線性關(guān)系，考察結(jié)果見(jiàn)表1。

進(jìn)樣量／（μg／mL）0.04 0.08 0.2 0.32 0.36進(jìn)樣量／μg 0.4 0.8 2.0 3.2 3.6峰面積／A 257 709.391 539 488.625 1 368 711.000 2 232 755.750 2 482 374.500

結(jié)果表明，芍藥苷在0.4～3.6μg的范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.8 陰性對(duì)照試驗(yàn)取不含白芍的陰性對(duì)照品適量，依上述方法測(cè)定。結(jié)果，白芍陰性樣品的色譜圖在芍藥苷峰相應(yīng)的保留時(shí)間附近無(wú)干擾峰出現(xiàn)。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)取本品3 g（批號(hào)040901），按正文擬定的含量測(cè)定方法測(cè)定，在0，2，6，10，16 h進(jìn)樣，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

如表2所示，在16 h內(nèi)，供試品溶液中芍藥苷的含量基本穩(wěn)定。

2.10 精密度試驗(yàn)精密吸取上述供試品溶液10μL（批號(hào)040901），注入液相色譜儀，重復(fù)5次，按色譜峰面積值計(jì)，結(jié)果ˉx＝483 362，RSD＝0.21%，表明其峰面積基本一致，所用儀器精密性良好。

2.11 重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一供試品（批號(hào)040901），依正文方法獨(dú)立測(cè)定5次，結(jié)果ˉx＝1.62 mg／片，RSD＝0.98%，表明該方法重現(xiàn)性很好。

2.12 回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取同法測(cè)定已知含量的供試品（批號(hào)040901）（含量：1.62 mg／片）6份，每份1 g，精密稱(chēng)定，置50 mL量瓶中，再分別加入芍藥苷對(duì)照品溶液（1 mL溶液中含0.2 mg芍藥苷）5，5，15，15，25，25 mL至上述瓶中，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，再分別精密加入70%乙醇溶液50 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min（250W，50 KHz），取出，放冷，稱(chēng)定重量，補(bǔ)足損失的70%乙醇量，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25mL，蒸至近干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，加氯仿提取兩次，每次25mL，棄去氯仿液，用水飽和正丁醇提取5次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別精密吸取上述溶液和對(duì)照品溶液（精密稱(chēng)取芍藥苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.05 mg的溶液，即得。）各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)見(jiàn)表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，本法回收率在98.4%～100.2%之間，平均回收率99.2%，RSD為0.66%，說(shuō)明加樣回收良好。準(zhǔn)確度較高。

3 樣品的測(cè)定結(jié)果

取3批樣品按正文方法條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 原料藥材的含量測(cè)定結(jié)果

依正文方法測(cè)定3批藥材含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 藥材含量測(cè)定結(jié)果

如表5所示，3批白芍含量均符合《中國(guó)藥典》2000年版一部相關(guān)規(guī)定?？捎糜谠撝苿┩读?。并定為藥材含量不得低于0.8%。

5 含量限度的確定

通過(guò)對(duì)3批樣品和3個(gè)產(chǎn)地藥材的含量測(cè)定可知，藥材平均含量為0.887%；樣品平均含量為1.617mg／片，考慮到原料藥材本身含量的變化及生產(chǎn)中的波動(dòng)，取其測(cè)定均值的80%為限度，暫定本品每片含赤芍以芍藥苷（C23H28O11）計(jì)，不得少于1.29mg。

［1］謝秀瓊.臨床新藥制劑開(kāi)發(fā)與應(yīng)用［M］.北京：人民出版社出版，1999：341.

R285.5

A

1007－4813（2010）05－0772－02

2010－06－21）

劉立輝（1972－），男，大學(xué)本科，主管藥師。研究方向：中藥制劑與質(zhì)量研究。