豬圓環(huán)病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展

葉 芬，蔡家利

（1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400715；2.重慶理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400050）

1 病毒基因組結(jié)構(gòu)及其編碼的主要蛋白

1.1 病毒的基因組結(jié)構(gòu)和特點(diǎn) PCV基因組為單鏈環(huán)狀DNA分子，根據(jù)PCV的致病性、抗原性及核酸序列，將PCV分為PCV1和PCV2兩個(gè)血清型。PCV1的基因組全長(zhǎng)為1 759bp，基本沒(méi)有致病性，PCV2的基因組全長(zhǎng)為1767bp或1768bp。兩個(gè)血清型的核苷酸的同源性低于80%，由基因序列推出的氨基酸的序列同源性小于76%。PCV2分離株間核苷酸的同源性大于94%，而PCV1分離株間核苷酸的同源性大于99%。

PCV基因組中含有圓環(huán)病毒所特有的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（Stem-loop structure），它是一保守的9核苷酸基序，序列為 TAGTATTAC（PCV1）或 AAGTATTAC（PCV2），這一序列對(duì)病毒DNA的復(fù)制非常關(guān)鍵，DNA的環(huán)復(fù)制就是從這里開始。莖環(huán)結(jié)構(gòu)下游有4個(gè)六聚體重復(fù)（5′-CGG-CAG-3，H1 H2 H3 H4），這些序列是病毒復(fù)制酶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。

Hamel等（1998）應(yīng)用軟件對(duì)PCV基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PCV1和PCV2均可能含有11個(gè)開放閱讀框（ORF）。其中 ORF1、2、3、4、7和 8具有一定的同源性，其余ORFs無(wú)任何同源性。編碼的蛋白大小從36 kDa～2 kDa不等?，F(xiàn)已證實(shí)，PCV有兩個(gè)主要的閱讀框:ORF1和ORF2，二者在長(zhǎng)度上都大于600bp。ORF1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，該蛋白氨基酸序列相當(dāng)保守，是PCV1和PCV2產(chǎn)生抗原交叉性的主要原因；而ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap，它是主要的免疫蛋白。

PCV2基因組的11個(gè)閱讀框大小相差懸殊（見表1）。其中 ORF1、ORF5、ORF7、ORF10，5′～3′方向相同；ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9、ORF11，5′～3′方向相同。這些閱讀框表現(xiàn)為重疊基因，從而充分利用了圓環(huán)病毒有限的遺傳物質(zhì)，這可能是生物進(jìn)化過(guò)程中自然選擇的結(jié)果。

表1 PCV2基因組的閱讀框概況

1.2 病毒編碼的主要蛋白

1.2.1 Rep蛋白 Rep蛋白與病毒基因組的滾環(huán)復(fù)制相關(guān)，由PCV最大的開放閱讀框ORF1編碼，分子量為 35.6 kDa（PCV1） 或 35.8 kDa（PCV2），由 312 aa（PCV1）或 314 aa（PCV2）組成。PCV1與 PCV2的蛋白氨基酸序列同源性達(dá)86%，這也是兩種血清型PCV產(chǎn)生抗原交叉性的主要原因所在。PCV1的Rep蛋白僅有 1 個(gè)糖基化位點(diǎn)，位于 20 aa～22 aa（NPS）；PCV2 的Rep蛋白則含有3個(gè)糖基化位點(diǎn)，位于23 aa～25 aa(NPS)，256aa～258aa（NQT）及 286aa～288aa（ZAT）。Rep蛋白具有與典型滾環(huán)復(fù)制（RCR）相關(guān)的3個(gè)保守基序Ⅰ（FTLNN）、Ⅱ（HLQG）、Ⅲ（YCSK）以及結(jié)合 dNTPs的P環(huán)（P-LOOP）結(jié)構(gòu)（序列為G-GKS），這些結(jié)構(gòu)對(duì)維持Rep蛋白的功能至關(guān)重要，突變或缺失均會(huì)影響病毒的復(fù)制，這也進(jìn)一步證明了PCV DNA是滾環(huán)式復(fù)制。Rep蛋白在所有圓環(huán)病毒中相對(duì)保守。系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析表明，圓環(huán)病毒的Rep蛋白可能是植物病原Nanovirus的Rep蛋白與小RNA樣病毒（如嵌杯樣病毒）RNA結(jié)合蛋白或原核生物的解旋酶發(fā)生重組的結(jié)果。

1.2.2 Cap蛋白 實(shí)驗(yàn)證明ORF2編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白（Cap蛋白），它是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒的核衣殼，在病毒感染細(xì)胞后在宿主各種酶的參與下產(chǎn)生。PCV1與PCV2的Cap蛋白均由233aa組成，氨基酸同源性僅為64%。兩種病毒的Cap蛋白都只有單一的糖基化位點(diǎn)，分別位于PCV2 Cap的143 aa～145aa（NYS）及 PCV1 的 102aa～104 aa（NYS）。

Nawagitgul等將ORF2基因克隆后于昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的分子量為30 kμ，與從純化的病毒粒子中監(jiān)測(cè)到的蛋白大小相似，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物能自動(dòng)組裝成病毒核衣殼樣顆粒，從而進(jìn)一步證實(shí)ORF2基因編碼病毒的核衣殼蛋白。血清學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，兩種血清型的Cap蛋白沒(méi)有抗原交叉性，這可能是因?yàn)檫@個(gè)共同抗原位點(diǎn)給整個(gè)Cap蛋白給掩蓋了。通過(guò)多肽掃描還發(fā)現(xiàn)，PCV2 Cap蛋白上存在三個(gè)特有的抗原位點(diǎn)（65aa～87aa，113aa～139aa及 193aa～207aa），這為建立特異性檢測(cè)PCV2的血清學(xué)方法奠定了基礎(chǔ)。目前，對(duì)PCV研究較深入的為ORF1和ORF2，同時(shí)由于ORF2的以上特性，其編碼產(chǎn)物就成為分子水平上診斷PCV的理想抗原，ORF2也成為研制基因工程疫苗的首選基因。因此，ORF2的研究已成為PCV2研究的熱點(diǎn)。

2 PCV2分子免疫學(xué)特性

有研究表明，PCV2能夠在其不復(fù)制或降解的情況下持續(xù)存在于DC細(xì)胞中，這種沉默病毒的感染同時(shí)提出了免疫逃避和DCs降解機(jī)制，而由于具有遷移能力，感染病毒的DCs是一種潛在的可在宿主體內(nèi)不需要復(fù)制就能傳播病毒的工具。Shibahara等也證實(shí)PCV2可以誘導(dǎo)淋巴系統(tǒng)中B細(xì)胞凋亡，使得抗原遞呈細(xì)胞遞呈抗原的能力減弱，同時(shí)降低了B淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的機(jī)能，因此PCV可以導(dǎo)致豬的免疫抑制。由于PCV2導(dǎo)致細(xì)胞因子mRNA表達(dá)失調(diào)，尤其是胸腺Ⅱ-10mRNA水平上升，必然嚴(yán)重?fù)p害豬群的免疫系統(tǒng)，從而為其他病原的侵襲創(chuàng)造了有利條件。

3 與分子生物學(xué)相關(guān)的檢測(cè)方法研究進(jìn)展

3.1 ELISA方法 林彥星等應(yīng)用原核表達(dá)的PCV2衣殼（Cap）蛋白作為診斷抗原，初步建立了一種檢測(cè)PCV2抗體的間接ELISA方法。實(shí)驗(yàn)表明該方法具有較高的敏感性和特異性，適于大規(guī)模檢測(cè)PCV2血清抗體的流行病學(xué)調(diào)查。秦承學(xué)等將PCV2 ORF1和ORF2基因分別插入桿狀病毒和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，用親和層析方法提純獲得重組衣殼（Cap）與復(fù)制（Rep）蛋白，用細(xì)胞融合技術(shù)獲得2株Cap和Rep蛋白單克隆抗體，以重組Cap和Rep蛋白作為抗原，通過(guò)反應(yīng)重要條件的優(yōu)化，建立了間接ELISA方法，有較好的特異性和重復(fù)性，可用于PCV2抗體檢測(cè)和疫苗免疫抗體鑒別診斷。

3.2 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA） 1998年Allan等將組織病料在PK215細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，用兔抗PCV高免血清培養(yǎng)細(xì)胞中的PCV進(jìn)行反應(yīng)，利用間接免疫熒光法對(duì)PCV進(jìn)行檢測(cè)和分型。該方法具有良好的特異性和敏感性，可滿足流行病學(xué)調(diào)查、臨床監(jiān)測(cè)和疫苗抗體水平檢測(cè)的需要。

3.3 PCR方法 PCR法是一種診斷快速和特異性高的診斷方法。目前用于PCV診斷的PCR法主要有常規(guī)PCR、復(fù)合PCR、套式PCR、競(jìng)爭(zhēng)PCR等方法。Quintana等對(duì)18種豬商品疫苗用PCR檢測(cè)PCV1和PCV2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有疫苗中未含有PCV2 DNA，僅有其中兩種疫苗檢出PCV1。此結(jié)果證明，PCR是檢測(cè)疫苗產(chǎn)品中是否含有外源PCV的快速敏感的方法，可用于豬疫苗質(zhì)量控制。馮志新等研究設(shè)計(jì)合成了一套引物和TaqMan探針，特異性擴(kuò)增PCV2-ORF2基因，通過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了快速定量檢測(cè)PCV2的實(shí)時(shí)PCR方法。該方法具有較好的特異性和重復(fù)性，對(duì)PCV2 DNA檢測(cè)的下限為1拷貝/μL，敏感性比常規(guī)PCR高106倍。

目前在規(guī)模化、集約化豬群中發(fā)生多病原混合感染、繼發(fā)感染的情況越來(lái)越常見，其中PCV2、豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬細(xì)小病毒（PPV）是較易混合感染的DNA病毒，常見于臨床病例中。由于多重PCR技術(shù)可在一份樣品中同時(shí)檢測(cè)多種病原體，且特異性和敏感性高，檢測(cè)時(shí)間短、成本低，在國(guó)外已作為一種新的檢測(cè)方法被應(yīng)用于臨床病例的檢測(cè)中。Lee Chulseung等構(gòu)建了可檢測(cè)和區(qū)分PRV、豬細(xì)胞巨化病毒（PCMV）和PCV2的多重PCR方法，此法對(duì)其他病毒、細(xì)菌和所用的Vero細(xì)胞未見有非特異性反應(yīng)，適用于檢測(cè)供異種組織器官移植的豬樣品中的這些病毒。

3.4 原位雜交（ISH）技術(shù) ISH具有高度敏感性，在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了多種方法。應(yīng)用ISH既可以對(duì)PCV1和PCV2進(jìn)行分型，又可以檢測(cè)PCV與其他病毒的混合感染。劉方娜等根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）基因序列，在ORF2內(nèi)設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增出371 bp的核酸片段，回收并純化PCR產(chǎn)物，用地高辛標(biāo)記，建立了地高辛標(biāo)記核酸探針診斷PCV2的方法。該探針與8個(gè)PCV2重組菌的核酸抽提物均能發(fā)生特異性雜交，而與對(duì)照組豬圓環(huán)病毒Ⅰ型（PCV1）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）的核酸雜交均為陰性；對(duì)PCV2 DNA的最低檢測(cè)量為10pg。

4 結(jié)語(yǔ)

自豬圓環(huán)病毒（PCV）發(fā)現(xiàn)以來(lái)，各國(guó)學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了深入研究。目前，PCV2及由其引起的PMWS等疾病已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)，也取得了不小的進(jìn)展，但仍有許多問(wèn)題尚待解決。由于目前仍然無(wú)有效的措施來(lái)防制豬圓環(huán)病毒病，所以仍需對(duì)PCV的分子生物學(xué)特性進(jìn)行深入研究，以進(jìn)一步弄清病毒基因組各ORFs及其編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、病毒的免疫學(xué)特性以及病毒的致病機(jī)理等，為PCV2的弱毒疫苗、亞單位疫苗以及重組活載體等疫苗的研制奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，力爭(zhēng)從根本上解決該病的防制問(wèn)題。

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