白細(xì)胞介素10對失血性休克大鼠肺的保護作用

劉 玉,談大海,,唐季春,,尤 杰,楊定清,張 焰,曾因明

(1.江蘇無錫市第四人民醫(yī)院麻醉科 214062;2.江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室,江蘇徐州221002)

失血性休克能夠誘發(fā)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的強烈激活,釋放大量的炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6以及 TNF-α等,導(dǎo)致急性肺損傷的發(fā)生進而可發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征甚至多器官功能不全,最后導(dǎo)致患者死亡[1]。白細(xì)胞介素10(IL-10)抑制膿毒血癥時促炎性因子IL-1、IL-6、IL-12以及 TNF-α的釋放,內(nèi)源性的IL-10在體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子平衡減輕炎性反應(yīng)方面發(fā)揮重要的作用[2-5]。本實驗采用失血性休克大鼠模型,應(yīng)用外源性重組人IL-10干預(yù),觀察其對失血性休克大鼠血液中促炎性細(xì)胞因子表達以及肺炎癥反應(yīng)程度的影響,并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組 選擇健康雄性SD大鼠24只,體重300～400g,由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。隨機分為3個組(n=8):假失血性休克對照(Control)組、休克(Shock)組和IL-10+休克(IL-10)組。重組人白細(xì)胞介素10(rhIL-10),由上海欣百諾生物科技有限公司提供。

1.2 失血性休克模型制作 大鼠于實驗前適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境7d,采用燈光照明的方法使晝夜時間均為24h,實驗前12h禁食不禁飲。腹腔注射2%戊巴比妥鈉50mg/kg麻醉后,仰臥固定于大鼠手術(shù)臺,分離一側(cè)股動、靜脈并置入22G套管,股動脈套管留作放血及監(jiān)測平均動脈壓,股靜脈套管留作注入復(fù)蘇液體和放出的血液。通過動脈以0.5mL/min速度放血,使平均動脈壓(MAP)達到50mm Hg,放出的血液儲存于無菌加肝素的容器,通過放出或回輸血液使MAP維持于 35～45mm Hg,持續(xù)120min[6]。

大鼠復(fù)蘇時采用其放出的自身血液加上等量的生理鹽水溶液,Shock實驗組大鼠在休克起始時皮下注射10 000單位的重組人IL-10(rhIL-10用2mL 0.9%氯化鈉溶解)[6-7],Shock組大鼠在休克起始時皮下注射2mL 0.9%氯化鈉溶液,Control組大鼠僅作動靜脈置管并維持測壓狀態(tài)同樣時程,然后拔除動、靜脈置管,結(jié)扎血管,縫合切口,放回原飼養(yǎng)場所待其自然清醒和自由飲食。實驗期間以白熾燈照大鼠,保持直腸溫度36.5～ 37.5℃。

1.3 標(biāo)本制備及檢測

1.3.1 復(fù)蘇24h時,放血活殺動物之前,經(jīng)由左心室采血3mL,1mL作血氣分析,剩余2mL分離血清,按試劑盒說明測定血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量。MDA試劑盒、SOD活性檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.2 支氣管肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞比值、肺通透指數(shù)及細(xì)胞因子測定。大鼠處死后,取全肺,剪開氣管,經(jīng)氣管插管緩慢注入4℃無菌生理鹽水灌洗2次,每次灌洗量為5mL。將2次回收的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)經(jīng)雙層無菌紗布過濾后3 000r/min離心15min,取細(xì)胞沉淀涂片,顯微鏡下計數(shù)肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞并計算所占百分比;Lowry法測定BALF和血漿蛋白含量,計算肺通透性指數(shù)(BALF蛋白含量/血漿蛋白含量);上清液于-20℃凍存,ELISA法測定灌洗液上清液及血液中IL-1、IL-6及TNF-α含量。IL-1、IL-6及 TNF-α試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.3.3 肺濕/干重(W/D)比測定 取右下肺葉組織,濾紙沾干肺表面水分,精確稱重后置烤箱60℃干燥至恒重后測定肺臟干質(zhì)量,計算肺濕干重以估計肺組織的水腫程度。肺濕/干重比(mg/g)=(肺濕重-肺干重)/肺干重。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行分析。所有數(shù)據(jù)以表示,組內(nèi)比較采用t檢驗,組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況及生存率 Control組大鼠不進行放血及復(fù)蘇,Shock組放血量(7.51±0.82)mL,IL-10組大鼠放血量(7.86±0.63)mL,組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。24h后Control組大鼠沒有死亡,Shock組大鼠在復(fù)蘇后2h內(nèi)死亡1只,5h死亡1只,24h死亡1只。IL-10組在休克復(fù)蘇后6h死亡1只,復(fù)蘇后24h死亡2只,與Shock組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 血清各項血氣指標(biāo) 與Control組相比,Shock組PaO2和pH值均明顯降低,二氧化碳分壓(PaCO2)明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與Shock組相比 IL-10組PaO2和pH值升高,PaCO2降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);IL-10組與Control組相比,PaO2、PaCO2和pH 值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.3 3個組大鼠肺通透指數(shù)(LPI)、肺濕/干重比值 與Control組相比,Shock組大鼠肺通透指數(shù)、肺濕/干重比顯著增大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與Shock組相比,IL-10組大鼠肺通透指數(shù)、肺濕/干重比值明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(表 2)。

表1 3個組大鼠各項血氣指標(biāo)的比較(n=8)

表1 3個組大鼠各項血氣指標(biāo)的比較(n=8)

▲:與Control組比較,P＜0.01;★:與Shock組比較,P ＜0.01。

組別 PaO2(kPa)PaCO2kPa)PH Control組 13.70±0.67 4.28±0.55 7.41 ±0.05 Shock組 7.21±0.84▲ 6.29±0.62▲ 7.26±0.05▲IL-10組 12.84±0.73★ 4.47±0.51★ 7.38±0.04★

表2 3個組大鼠W/D比值、LPI和BA LF中性粒細(xì)胞比值(n=8)

表2 3個組大鼠W/D比值、LPI和BA LF中性粒細(xì)胞比值(n=8)

▲:與Control組比較,P＜0.01;★:與 Shock組比較,P＜0.01。

組別 W/D比值 LPI(10-3)BA LF中性粒細(xì)胞(%)Control組 4.65±0.15 5.12±0.36 15.6±4.3 Shock組 7.03±0.12▲ 13.61±0.54▲ 56.89±7.8▲IL-10組 5.17±0.22★ 5.81±0.42★ 27.1±5.6★

2.4 3個組大鼠支氣管肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞比值 結(jié)果見表2,與Control組相比,Shock組大鼠支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)明顯增多,中性粒細(xì)胞計數(shù)比顯著增大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);IL-10組與Shock組相比,大鼠支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)比明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.5 3個組大鼠血清中SOD、M DA含量的比較 Shock組大鼠血清中MDA水平較Control組顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),而IL-10組較Shock組則明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);RL組大鼠血清中SOD水平較Control組顯著下降,而IL-10組較Shock組則顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),見表 3。

2.6 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液上清液及血清中IL-1、IL-6、TNF-α水平 Shock組大鼠支氣管肺泡灌洗液中 IL-1、IL-6、TNF-α水平較Control組顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),而 IL-10組較RL組則明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),見表 4。

表3 3個組大鼠血清中SOD和M DA含量的比較(n=8)

表3 3個組大鼠血清中SOD和M DA含量的比較(n=8)

▲:與Control組比較,P＜0.01;★:與 Shock組比較,P＜0.01。

組別 MDA含量(nmol/mL)SOD含量(u/mL)Control組 3.75±0.62 85.17±9.41 Shock組 7.32±0.54▲ 36.28±7.37▲IL-10組 4.19±0.73★ 67.91±13.82★

表4 3組大鼠支氣管肺泡灌洗液上清液及血液中IL-1、IL-6、TNF-α水平pg/mL)

表4 3組大鼠支氣管肺泡灌洗液上清液及血液中IL-1、IL-6、TNF-α水平pg/mL)

▲:與Control組比較,P＜0.01;★:與 Shock組比較,P＜0.01。

IL-1IL-6TNF-α組別BALF 血清BALF 血清BA LF 血清Control組 30.5±16.8 152.6±63.4 42.7±14.5 85.8±13.4 58.1±34.9 265.8±103.7 Shock組 178.3±42.1▲ 461.7±193.6▲ 171.9±88.3▲ 424.6±182.9▲ 670.8±227.4▲ 1 869.6±732.8▲IL-10組 91.4±57.6★ 217.5±165.8★ 61.9±32.6★ 128.3±93.4★ 162.9±78.1★ 610.5±279.3★

3 討 論

失血性休克是創(chuàng)傷后患者死亡的主要原因之一。早期階段患者死亡主要是由于出血沒有得到控制,經(jīng)歷休克和復(fù)蘇存活的患者往往會發(fā)生難以控制的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致終末器官損傷甚至死亡,而急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征則是主要的死亡原因[8]。

在急性肺損傷發(fā)生的過程中,促炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和 TNF-α的大量釋放發(fā)揮關(guān)鍵的作用[1]。IL-10是一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子,能夠減輕多種創(chuàng)傷刺激后過度的炎癥反應(yīng)。IL-10通過抑制NF-κ B等途徑抑制促炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12 等的合 成[3,9-12],促進 中性 粒細(xì)胞 凋亡[13],從而減輕肺部的炎癥反應(yīng)。同時IL-10缺陷的大鼠失血性休克后易于并發(fā)肺部損傷而肝臟損傷的概率并沒有增加[14],而外源性的IL-10應(yīng)用也顯示能夠減輕傷害刺激誘發(fā)的免疫功能障礙[15]。

在傷害刺激后IL-10的釋放或者給予IL-10顯示良好的效應(yīng)[16],在休克的早期應(yīng)用 IL-10能夠減少 TNF-α的劇烈增加[6]。本研究結(jié)果證明在失血性休克起始階段給予外源性的重組白細(xì)胞介素10與單純復(fù)蘇相比在各項血氣指標(biāo)方面得到了很大的改善,說明給與rhIL-10能夠改善肺泡的氧合。本研究結(jié)果顯示IL-10組大鼠肺濕/干重、肺通透指數(shù)與Shock組大鼠相比均有明顯的降低,IL-10組血清中 MDA含量低于Shock組,而SOD含量高于Shock組,說明 HSPTX復(fù)蘇失血性休克大鼠能夠降低肺毛細(xì)血管通透性。同時,結(jié)果顯示IL-10組大鼠BALF上清液及血液中 IL-1、IL-6、TNF-α水平較Shock組顯著降低,表明給予IL-10可以有效地減少促炎性細(xì)胞因子的釋放并減輕肺部的炎癥反應(yīng),盡管實驗結(jié)果與Karakozis等[6]并不完全一致。

值得注意的是,本實驗選擇的時間點是失血性休克復(fù)蘇后24h,在24h內(nèi)雖然IL-10組的肺部炎癥反應(yīng)得到了有效的控制,然而IL-10組與Shock組相比生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究沒有觀察遠(yuǎn)期時間點肺部炎癥反應(yīng)的變化和生存率的比較,因此,可能給予外源性的IL-10只是推遲炎癥反應(yīng)而沒有阻止炎癥反應(yīng)。IL-10的過量釋放本身會導(dǎo)致機體免疫機能的低下,增加感染的可能性,尤其是在膿毒血癥的患者是非常有害的[16]。在無菌性炎癥中,IL-10能夠發(fā)揮良好的抗炎效應(yīng),但是也有可能抑制機體的免疫功能,增加機體后期致命性感染的發(fā)生,因此,臨床上應(yīng)用IL-10還需要進一步的驗證。

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