RNA干擾沉默雄激素受體基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用研究*

王洛夫,張 堯,蘭衛(wèi)華,靳風(fēng)爍,江 軍

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科,重慶400042)

前列腺癌具有雄激素依賴性,抗雄激素治療至少對(duì)80%的晚期前列腺癌有效,但絕大多數(shù)患者會(huì)在短期內(nèi)發(fā)展為雄激素非依賴性前列腺癌,缺乏有效的治療方法[1-2]。目前有研究認(rèn)為,前列腺癌的雄激素依賴性主要是雄激素受體(androgen receptor,AR)依賴性,AR不但在雄激素依賴性前列腺癌中具有重要作用,在雄激素非依賴性前列腺癌中也起著關(guān)鍵作用[3-4],因此,可針對(duì) AR基因進(jìn)行前列腺癌的基因治療。RNA干擾(RNAi)具有高效、高度基因特異性的特點(diǎn),能沉默所有已知序列的基因,采用 RNA干擾技術(shù)沉默AR基因,將可能有效地抑制AR的表達(dá),從而抑制前列腺細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此,本研究擬設(shè)計(jì)合成針對(duì)AR基因的小干擾RNA(siRNA)并轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞,觀測(cè)其對(duì)AR基因的沉默作用及對(duì)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)選用人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP(購自美國ATCC),該細(xì)胞表達(dá) AR,具有雄激素依賴性,同時(shí)該細(xì)胞對(duì)雌激素、孕激素甚至抗雄激素藥物敏感,具有雄激素非依賴性前列腺癌的特性。siRNA合成試劑盒Silencer·siRNA Construction Kit、siRNA轉(zhuǎn)染試劑 siPORTTMLipid Transfection Agent購自美國 Ambion公司,ReverTra Ace-α-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TOYOBO公司。

1.2 AR siRNA的設(shè)計(jì) 利用Ambion公司提供的siRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)針對(duì) AR cDNA(GeneBank序列號(hào):M23263 N18624)符合特征的靶序列,同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照序列(GC含量與靶序列相同)。經(jīng)初步分析選取了3個(gè)靶序列:5′-AAT GCA AAG GT T CTC TGC TAG-3′(位于 Exon1),5′-AAG GTC TTC TTC AAA AGA GCC-3′(位 于 Exon2),5′-AAA GTC AAG CCC ATC TAT TTC-3′(位于 Exon8);陰性對(duì)照序列 :5′-AAG TGC GAT CTA ACT GAC CTA-3′。 根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)用于合成siRNA的寡核苷酸模板,反義鏈為靶序列,正義鏈為靶序列的互補(bǔ)序列,3′加T7啟動(dòng)子引物序列CCTGTCTC。以上寡核苷酸模板均由上海生工生物工程公司合成。

1.3 AR siRNA的制備 采用 Ambion公司的Silencer·siRNA Construction Kit合成上述AR siRNA,按試劑盒操作說明書取等摩爾濃度的正、反義寡核苷酸模板與T7啟動(dòng)子混合,70℃加熱混合物5min,室溫下放置5min,T7啟動(dòng)子和寡核苷酸模板序列退火結(jié)合,然后用DNA聚合酶Klenow大片段補(bǔ)齊成為可用于轉(zhuǎn)錄的雙鏈DNA模板,分別用T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,再將產(chǎn)物混合后于37℃水浴箱持續(xù)孵育過夜,形成雙鏈RNA。以DNA酶降解模板,同時(shí)用單鏈專一的核糖核酸酶(RNase)消化5′的引導(dǎo)序列,由于 RNase不能切開 U堿基,也不能降解雙鏈 RNA,所以得到的產(chǎn)物就是所需的21bp的雙鏈 siRNA,有19對(duì)堿基互補(bǔ),3′端各有2個(gè) U突出。按試劑盒操作說明書進(jìn)行純化,得到的siRNA用去核酸酶的水溶解,紫外分光光度計(jì)定量,-20℃保存?zhèn)溆?。?種靶序列合成的AR siRNA依次命名為AR siRNAⅠ、AR siRNAⅡ、AR siRNAⅢ。

1.4 AR siRNA轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LNCaP細(xì)胞接種于6孔板(5×105/孔),培養(yǎng)細(xì)胞至密度為50%～60%。采用siPORTTMLipid T ransfection Agent進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染,簡(jiǎn)要步驟如下:取4μ L siPORTTMLipid Transfection A-gent,加入OPTI-MEM Ⅰ reduced serum medium使終體積為15μ L,充分混勻,室溫孵育 10～30min。用OPTI-MEM Ⅰ reduced serum medium稀釋 siRNA至終體積 185μ L(終濃度25nM)。將稀釋的siRNA加入到稀釋的siPORTTMLipid Transfection Agent中,室溫孵育 15～20min。用 OPTI-MEMⅠreduced serum medium將細(xì)胞洗一遍,然后加入新鮮的OPTI-MEM Ⅰ 至800μ L。加入 siPORTTMLipid T ransfection A-gent/siRNA復(fù)合物至每孔,使終體積為1 000μ L,在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下孵育4h,加1～2mL新鮮的常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每種AR siRNA轉(zhuǎn)染重復(fù)3次,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,挑選對(duì)LNCaP抑制作用最強(qiáng)的一組AR siRNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 AR siRNA對(duì)AR基因轉(zhuǎn)錄的影響 實(shí)驗(yàn)分3個(gè)組,A組:以抑制作用最強(qiáng)的AR siRNA轉(zhuǎn)染LNCaP,稱為 AR siRNA干預(yù)組;B組:以陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染LNCaP,稱為無關(guān)對(duì)照組(mock control);C組:只加脂質(zhì)體,稱為空白對(duì)照組(control)。轉(zhuǎn)染48h后,采用 Trizol試劑(Invitogen)提取細(xì)胞總RNA,用DNA酶消化后,電泳證實(shí)提取 RNA成功,以隨機(jī)六聚體引物反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,反應(yīng)條件:42℃、10min→30℃、20min→99℃、5min→4℃、5min,然后以 A R 引物 P1、P2 進(jìn)行PCR,以 GAPDH 作為內(nèi)參照,引物序列:P1 5′-AAG CCA TTG AGC CAG GTG TAG TG-3′,P2 5′-AAC CAG ATC AGG GGC GAA GTA GA-3′,GAPDH 引物:5′-ACC CAT CAC CAT CTT CCA GGA G-3′(上 游 引 物),5′-GAA GGG GCG GAG ATG ATG AC-3′(下游引物),反應(yīng)條件:94℃、5min→(94℃、30s→58℃、30s→72℃、30s)×28→72℃、10min,擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度 AR為 275bp,GAPDH為159bp。PCR產(chǎn)物采用圖像掃描儀拍照并進(jìn)行灰度分析,以AR/GAPDH的比值代表相對(duì)含量。

1.6 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 接種LNCaP于24孔板,每孔接種3×104個(gè)細(xì)胞,24h后按上述分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染,次日開始每天消化3孔記數(shù),取平均值,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制百分率,計(jì)算公式:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制百分率(%)=(Nn-N)/(Nn-N0)×100%。其中N0為始接種細(xì)胞數(shù),N為AR siRNA干預(yù)組細(xì)胞接種n天后的細(xì)胞數(shù),Nn為對(duì)照組細(xì)胞接種n天后的細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA的合成 采用Ambion公司的Silencer·siRNA Construction Kit合成的 AR siRNA是雙鏈 RNA,長(zhǎng)度為21bp,經(jīng)凝膠電泳證實(shí)成功合成了AR siRNA(圖1)。

2.2 AR siRNA轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 將合成的3種AR siRNA轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞LNCaP,與陰性對(duì)照和空白對(duì)照相比,發(fā)現(xiàn)3種A R siRNA對(duì)LNCaP細(xì)胞均有不同程度的抑制作用,但以AR siRNAⅡ?qū)NCaP細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng),表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、脫壁,而對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,故選擇AR siRNAⅡ進(jìn)行進(jìn)一步的研究(圖2)。

2.3 AR siRNA對(duì)AR基因轉(zhuǎn)錄的影響 為明確AR siRNAⅡ轉(zhuǎn)染對(duì)靶基因的影響,本科進(jìn)行了RT-PCR。結(jié)果表明,AR siRNAⅡ轉(zhuǎn)染 LNCaP細(xì)胞48h后,AR mRNA水平明顯下調(diào),與空白對(duì)照組和無關(guān)對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(0.302±0.028)vs(0.494±0.032),P＜0.01;(0.302±0.028)vs(0.534±0.034),P＜0.01〕,而無關(guān)對(duì)照組不引起靶基因AR mRNA水平的明顯變化〔(0.534±0.034)vs(0.494±0.032),P＞0.05〕,見圖 3。

圖1 合成的AR siRNA凝膠電泳(1%瓊脂糖凝膠)結(jié)果

圖2 各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況(光鏡 ×100)

圖3 RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳(1%瓊脂糖凝膠)結(jié)果

圖4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 按上述分組繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖4),可見AR siRNA干預(yù)組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯被抑制,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(相對(duì)空白對(duì)照組)為78.2%。

3 討 論

前列腺癌是西方工業(yè)國家最常見的惡性腫瘤之一,是美國男性常見的惡性腫瘤,其死亡率僅次于肺癌,居男性癌癥死亡的第2位;中國前列腺癌的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。前列腺癌具有雄激素依賴性,抗雄激素治療至少對(duì)80%的晚期前列腺癌有效,但絕大多數(shù)患者會(huì)在短期內(nèi)發(fā)展為雄激素非依賴性前列腺癌,缺乏有效的治療方法[1-2]。

目前,研究認(rèn)為,前列腺癌的雄激素依賴性主要是AR依賴性,AR不單在雄激素依賴性前列腺癌中具有重要作用,在雄激素非依賴性前列腺癌中也起著關(guān)鍵作用[3-4],表現(xiàn)在:(1)AR表達(dá)增加,幾乎所有雄激素非依賴性前列腺癌均表達(dá)AR,且大多數(shù)病例高于原發(fā)性腫瘤。AR表達(dá)增加的機(jī)制之一是AR基因擴(kuò)增,在進(jìn)行抗雄激素治療后發(fā)生雄激素非依賴性轉(zhuǎn)變的前列腺癌患者,約30%有AR基因擴(kuò)增。A R表達(dá)增加使得在低濃度雄激素環(huán)境中雄激素-雄激素受體通路仍可被激活。(2)AR基因突變,突變的AR可被雄激素以外的甾體激素激活。(3)生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子以配基非依賴的方式激活。(4)過量表達(dá)AR共激活因子,如ARA-70等,使 AR的活性大幅度提高。這些細(xì)胞盡管對(duì)抗雄激素治療抵抗,但卻對(duì)AR具有高度依賴性,因此,阻斷這些細(xì)胞的AR表達(dá)應(yīng)該可以起到治療作用。這對(duì)攻克雄激素非依賴性前列腺癌這一前列腺癌治療領(lǐng)域的難題無疑是有益的嘗試。Eder等[5]采用AR反義寡核苷酸阻斷AR蛋白表達(dá),抑制了前列腺癌細(xì)胞LNCaP的生長(zhǎng),本科采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的 AR反義RNA抑制AR表達(dá)也取得了類似的結(jié)果[6-7]。因LNCaP具有雄激素非依賴性前列腺癌的一些特性,如在無雄激素的環(huán)境中,雌激素、孕激素、細(xì)胞因子等仍能通過激活A(yù)R而使LNCaP生長(zhǎng)。因此,上述研究表明AR在雄激素非依賴性前列腺癌的治療中極具價(jià)值。但這些實(shí)驗(yàn)中反義核酸對(duì)AR表達(dá)的抑制程度及對(duì)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度仍偏低,仍需尋找更有效的方法。

RNA干擾是一種在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入與特定基因序列相同的雙鏈RNA(dsRNA)而特異關(guān)閉基因的方法,即用20多個(gè)核苷酸組成的siRNA代替?zhèn)鹘y(tǒng)反義核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默,目前該技術(shù)已經(jīng)迅速而廣泛地應(yīng)用到基因功能、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究等熱門領(lǐng)域,并為基因治療開辟了新的途徑[8-9]。RNAi具有高效、高度基因特異性的特點(diǎn),能沉默所有已知序列的基因,且RNA干擾在基因沉默方面比反義RNA和反義寡核苷酸更有效。因此,設(shè)計(jì)合成針對(duì)AR的特異dsRNA并導(dǎo)入到前列腺癌細(xì)胞,使AR基因沉默,將可能更有效地抑制AR的表達(dá),從而抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。所以,本研究在既往研究的基礎(chǔ)上,選用RNA干擾技術(shù)沉默雄激素受體基因。

通過設(shè)計(jì)、合成多個(gè)AR siRNA,轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞LNCaP,本研究篩選出了一個(gè)對(duì)其生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)的AR siRNA,RT-PCR證實(shí)前列腺癌細(xì)胞的AR mRNA水平顯著降低,LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)被顯著抑制,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為78.2%。以上結(jié)果表明AR siRNA可沉默AR基因,并進(jìn)一步抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。由于LNCaP存在基因突變,雌激素、孕激素甚至抗雄激素藥物可刺激其生長(zhǎng),具有雄激素非依賴性前列腺癌的一些特征,故本研究結(jié)果提示AR siRNA可能對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌也有生長(zhǎng)抑制作用。

[1]吳綺思,羅春麗.前列腺干細(xì)胞抗原與前列腺癌的研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué),2008,37(13):1424.

[2]Kasper S,Cookson MS.Mechanisms leading to the development of hormone-resistant prostate cancer[J].Urol Clin North Am,2006,33(2):201.

[3]Sharifi N,Farrar WL.Androgen receptor as a therapeutic target for androgen independent prostate cancer[J].Am J Ther,2006,13(2):166.

[4]Eder IE,Haag P,Bartsch G,et al.Targeting the androgen receptor in hormone-refractory prostate cancer-new concepts[J].Future Oncol,2005,1(1):93.

[5]Eder IE,Hoffmann J,Rogatsch H,et al.Inhibition of LNCaP prostate tumor growth in vivo by an antisense oligonuceotide directed against the human androgen receptor[J].Cancer Gene Ther,2002,9(2):117.

[6]江軍,王洛夫,方玉華,等.雄激素受體反義RNA對(duì)前列腺癌 LNCaP生長(zhǎng)特性的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,25(16):1410.

[7]王洛夫,江軍,方玉華,等.雄激素受體反義寡核苷酸對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用[J].中華泌尿外科雜志,2003,24(6):383.

[8]Gaur RK.RNA interference:a potential therapeutic tool for silencing splice isoforms linked to human diseases[J].Biotechniques,2006,28(1):15.

[9]黃環(huán),吳永忠.RNA干擾技術(shù)及其在腫瘤研究中的進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué),2008,37(2):198.