Survivin、VEGF、Caspase-3 在血管瘤不同時(shí)期的表達(dá)及其相關(guān)性研究

張莉 張成書(shū) 李旭文 王懷谷 徐靜 李光早 林曉曦

血管瘤是嬰幼兒最常見(jiàn)的良性腫瘤，其確切的發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明[1]。血管瘤具有很奇特的自然病程：出生后1～12個(gè)月瘤體迅速增大（增生期），隨后的2～5年內(nèi)出現(xiàn)緩慢的、必然的消退（消退期）。由于這一特殊的生物學(xué)現(xiàn)象，血管瘤增生與消退的機(jī)制一直是人們研究的熱點(diǎn)。張莉等[2]用基因芯片技術(shù)檢測(cè)增生期和消退期血管瘤差異基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)大量與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因在增生期高表達(dá)，而與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因在消退期高表達(dá)，提示血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡與血管瘤的增生和消退密切相關(guān)，即血管瘤的增生和消退可能就是血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的外在表現(xiàn)，但引起血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)擬用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)不同時(shí)期血管瘤組織中的Survivin、VEGF和活化Caspase-3的表達(dá)，并且進(jìn)行相關(guān)性分析，探討上述分子的變化對(duì)血管瘤增生、消退病程演化的影響，為臨床治療血管瘤提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集我院病理科2005年至2008年血管瘤蠟塊標(biāo)本45例，其中女性35例，男性10例；年齡最小1月齡，最大5歲。依據(jù)Mulliken對(duì)血管瘤的分期標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理證實(shí)，確診增生期血管瘤30例，消退期血管瘤15例。另以瘤體周圍正常皮膚組織15例為正常對(duì)照。

1.2 免疫組化染色

1.2.1 載玻片的處理

重鉻酸鉀-硫酸液浸泡24 h，用流水沖洗2 h，置于60℃溫箱中烤干，并以1∶10多聚L-賴氨酸溶液浸數(shù)秒，瀝干，置于60℃溫箱中烤干備用。

1.2.2 免疫組化染色

石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后，蒸餾水沖洗3遍，滴加3%H2O2，室溫孵育10 min，置于抗原修復(fù)液，中火修復(fù)10 min，室溫冷卻20 min，蒸餾水沖洗2遍，0.1%PBS液沖洗2遍，甩去PBS液，滴加50 μL非免疫動(dòng)物血清，室溫下孵育10 min，滴加一抗50 μL，4℃溫箱中過(guò)夜。切片取出后PBS沖洗3 min（3次），滴加生物素標(biāo)記的第二抗體50 μL，室溫下孵育 10 min，PBS 液沖洗 3 min（3 次），滴加鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液50 μL，室溫下孵育 10 min，PBS液沖洗 3 min（3次），滴加 100 μL新鮮配置的二氨基苯聯(lián)氨（DAB），顯色5 min，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。分別設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照即試劑公司提供的陽(yáng)性照片，陰性對(duì)照為一抗用PBS液。

1.2.3 染色結(jié)果的評(píng)定

由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)定。光鏡下觀察，免疫組織化學(xué)染色顯示：VEGF陽(yáng)性時(shí)，細(xì)胞質(zhì)有棕黃色細(xì)顆粒沉著；Caspase-3陽(yáng)性時(shí)，胞漿或胞核出現(xiàn)黃色、棕黃色、棕褐色細(xì)顆粒沉著；Survivin陽(yáng)性時(shí)，胞核出現(xiàn)棕黃色、棕褐色細(xì)顆粒沉著。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如下：以同一顯微鏡倍數(shù)（400×）觀察全片，選擇5個(gè)高倍視野，合并計(jì)算所分析的5個(gè)不同視野染色的強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分率。基本不染色者為0分，染色淡者為1分，染色中等者為2分，染色深者為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分率小于5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為 2分，大于 51%為3分。將每張片子的染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞百分率得分各自相乘，則為陽(yáng)性系數(shù)。陽(yáng)性系數(shù)0～1分者為陰性（-），2～3 分者為弱陽(yáng)性（＋），4～6 分者為中等陽(yáng)性（＋＋），9 分者為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）。 陽(yáng)性表達(dá)率以表達(dá)陽(yáng)性的病例（包括弱陽(yáng)性、中等陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性之和）占總病例數(shù)的百分比表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以SPSS 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)方法為Kuskal-Wallis H檢驗(yàn)、Mann-Whittney U檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin在血管瘤和正常組織中的表達(dá)

Survivin主要在血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞核中表達(dá)，增生期陽(yáng)性（+～＋＋＋）表達(dá)率為 80%（24/30）；消退期陽(yáng)性（+～＋＋＋）表達(dá)率為 60%（9/15）；在正常組織中不表達(dá)。血管瘤增生期與消退期的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；增生期和消退期分別與正常組織比較，差異均有顯著意義（P<0.01）（表 1）。

表1 Survivin在血管瘤及正常組織中的表達(dá)

2.2 VEGF在血管瘤和正常組織中的表達(dá)

VEGF主要在血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿和胞膜表達(dá)，增生期和消退期陽(yáng)性（+～＋＋＋）表達(dá)率分別為90%（27/30）和 46.7%（13/15），具有顯著性差異（P<0.01）；在正常組織不表達(dá)。增生期與消退期血管瘤與正常組織相比，差異均具有顯著意義（P<0.01）（表2）。

表2 VEGF在血管瘤及正常組織中的表達(dá)

2.3 活化Caspase-3在增生期、消退期血管瘤及正常組織中的表達(dá)

血管瘤中活化Caspase-3增生期主要在內(nèi)皮細(xì)胞核中表達(dá)，消退期也出現(xiàn)在胞漿中，增生期和消退期陽(yáng)性（+～＋＋＋）表達(dá)率分別為 60.0%(18/30)和 86.7%(13/15)，在正常組織中不表達(dá)。血管瘤在增生期與消退期的差異具有顯著意義（P<0.01），增生期、消退期與正常組織的差異均有顯著意義（P<0.01）（表3）。

表3 活化Caspase-3在血管瘤及正常組織中的表達(dá)

2.4 血管瘤組織中Survivin和VEGF的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，Survivin和 VEGF在45例血管瘤組織的表達(dá)具有正相關(guān)性 （r=0.54，P<0.01）（表 4）。

表4 血管瘤中Survivin和VEGF表達(dá)的相關(guān)性

2.5 血管瘤組織中Survivin和活化Caspase-3的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，Survivin和活化Caspase-3在45例血管瘤組織的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性（r=-0.51，P<0.01）（表 5）。

表5 血管瘤中Survivin、Caspase-3表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

血管瘤增生和消退的確切發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)因子在該機(jī)制中的作用是目前研究的熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VEGF在增生期血管瘤的陽(yáng)性率為90%（27/30），明顯高于消退期和正常組織，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)分子，其活化可誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，并可能最終導(dǎo)致血管瘤的自發(fā)消退[4]。本實(shí)驗(yàn)顯示，活化Caspase-3在消退期的陽(yáng)性率為86.7%，明顯高于增生期血管瘤（60.0%）和正常組織（不表達(dá)）。Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的、最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白，表達(dá)不足可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞及新生毛細(xì)血管的退化[5]。我們發(fā)現(xiàn)，其在增生期血管瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率（80%）明顯高于消退期（60%）和正常組織（不表達(dá)），提示Survivin可抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管瘤組織增生，是調(diào)控血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的重要基因之一。

通過(guò)等級(jí)相關(guān)分析，我們發(fā)現(xiàn)血管瘤組織中VEGF和Survivin的表達(dá)具有強(qiáng)正相關(guān)性，提示血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin的高表達(dá)可能與VEGF表達(dá)上調(diào)有關(guān)。VEGF刺激血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增生，還通過(guò)Survivin抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，它們共同作用促成了血管瘤早期的快速增生。Survivin在增生期血管瘤高表達(dá)，在退化期血管瘤中低表達(dá)；而活化Caspase-3的表達(dá)則相反，兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)在血管瘤的增生過(guò)程中，Survivin可能通過(guò)抑制Caspase-3而參與了血管瘤的發(fā)生；相反，血管瘤的消退則可能是由于Survivin的表達(dá)降低，Caspase-3的活性增高，誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡所致。

我們對(duì)比了血管瘤增生期和消退期中Survivin、VEGF、Caspase-3的表達(dá)及其相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)三者在血管瘤的不同時(shí)期表達(dá)不同，且具有相關(guān)性，其差異變化可能主導(dǎo)了血管瘤增生、消退的演化過(guò)程。結(jié)果提示，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)的VEGF一方面促進(jìn)自身的增殖，另一方面上調(diào)了Survivin的表達(dá)，抑制了Caspase-3等凋亡蛋白的活性，從而導(dǎo)致了血管瘤早期的快速增生；相反，VEGF的表達(dá)下調(diào)，減少了凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)，使凋亡蛋白Caspase-3等活性升高，促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，使血管瘤趨于消退。結(jié)合文獻(xiàn)分析[6-7]，可以推測(cè)，在血管瘤的增生與消退過(guò)程中，VEGF/Survivin抑制Caspase-3的途徑可能起著關(guān)鍵性的作用，將來(lái)有望通過(guò)改變VEGF/Survivin抑制Caspase-3的途徑中的某一環(huán)節(jié)，如用反義核苷技術(shù)和/或RNA干擾技術(shù)等阻斷VEGF或Survivin在血管瘤中的表達(dá)，提高Caspase-3的活性，誘發(fā)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)血管瘤的早日消退，為血管瘤的基因治療開(kāi)辟新的途徑。

[1]Lo K,Mihm M,Fay A.Current theories on the pathogenesis of infantile hemangioma[J].Semin Ophthalmol,2009,24(3):172-177.

[2]張莉,王煒,祁佐良,等.用基因芯片研究同一血管瘤增生和消退期差異表達(dá)基因[J].中華整形外科雜志,2003,19(6):452－455.

[3]Zhang L,Lin X,Wang W,et al.Circulating level of vascular endothelial growth factor in differentiating hemangioma from vascular malformation patients[J].Plast Reconstr Surg,2005,116(1):200-204.

[4]陳志雄,張端蓮,陜聲國(guó),等.Caspase-3在人皮膚血管瘤不同時(shí)期的表達(dá)及意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2004,21(9):1109-1110.

[5]O'Connor DS,Schechner JS,Adida C,et al.Control of apoptosis during angiogenesis by survivin expression in endothelial cells[J].Am J Pathol,2000,156(2):393-398.

[6]Tran J,Rak J,Sheehan C,et al.Marked induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin and XIAP by VEGF in vascular endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,1999,264(3):781-788.

[7]Shin S,Sung BJ,Cho YS,et al.An anti-apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and-7[J].Biochemistry,2001,40(4):1117-1123.