葛根素衍生物4ac對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血液流變學(xué)的影響*

董鑫鑫，高書亮，肖 誠，趙宏艷，王 燕，呂 誠，楊大堅(jiān)，呂愛平△

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究所，北京 100700;2.江西中醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330004;3.中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029;4.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;5.香港理工大學(xué)深圳現(xiàn)代中藥研究所，廣東深圳 518000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、對(duì)稱性、多發(fā)性并以關(guān)節(jié)損害為表現(xiàn)的自身免疫性疾病，其早期病變主要在滑膜。目前尚無特效藥物，常用的有非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、青霉胺、免疫抑制劑等藥物，但均存在一定的毒副作用，因此科研工作者一直致力于尋找新型的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物。

葛根素是從豆科植物野葛的干燥根中提取并分離出來的一種異黃酮化合物，其具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抗血小板凝集等作用，臨床上常用于治療冠心病、心絞痛及腦血栓等疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2～4]，RA患者及動(dòng)物模型均出現(xiàn)微循環(huán)和血液流變學(xué)方面的異常，因此葛根素是否對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有治療作用，是本研究所關(guān)注的問題。葛根素的衍生物—葛根素經(jīng)乙酰化反應(yīng)生成的衍生物(4ac)是對(duì)葛根素化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了一系列的修飾，其穩(wěn)定性和生物利用度都較葛根素明顯提高[5～7]。本實(shí)驗(yàn)主要觀察其對(duì)CIA大鼠的治療作用及其對(duì)血液流變學(xué)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重160g±10g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級(jí)動(dòng)物室喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室許可證號(hào)SYXK(京)2005-0024。

1.1.2 主要藥物與試劑 葛根素衍生物4ac由香港理工大學(xué)楊大堅(jiān)教授提供，經(jīng)HPLC法測定含量均在98%以上;烏拉坦:北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)040427;枸櫞酸鈉:北京化工廠，批號(hào)950207;ADP:美國Sigma公司，批號(hào)951104;凝血酶(FIB):上海太陽試劑公司，批號(hào)136011;II型膠原(CII)、不完全弗氏佐劑(IFA):美國Chondrex公司產(chǎn)品，批號(hào)070347、080073。

1.1.3 主要儀器 LBY-W6A型自清洗旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)、LBY-NW1型毛細(xì)管黏度計(jì)、C2000-4血凝儀(北京普利生儀器公司);PA-3210型血小板聚集儀(日本DIC公司);KH-120A微量毛細(xì)管離心機(jī)(日本);LXJ-Ⅱ離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 實(shí)驗(yàn)開始第1天取適量大鼠Ⅱ型膠原，將其溶于0.1M乙酸配成濃度為2 mg/mlⅡ型膠原溶液，4℃過夜。此溶液再與等量不完全弗氏佐劑混合，充分乳化后以滴加于水中不擴(kuò)散為度，取乳化后的混合物按200μgⅡ型膠原/只大鼠，于尾根部皮下免疫，1周后按100μgⅡ型膠原/只于尾根部皮下加強(qiáng)免疫1次。正常組以等量生理鹽水于尾根部進(jìn)行皮下假免疫。

1.2.2 分組與給藥方法 隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、地塞米松組、4ac高劑量組、4ac低劑量組5組，每組12只。于免疫12d開始腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)4周。給藥劑量如下:DEX組0.2mg/kg·d[8]、4ac 低劑量 45mg/kg·d、4ac 高劑量組90mg/kg·d，空白對(duì)照組和模型組腹腔注射等量的生理鹽水。造模當(dāng)天測量動(dòng)物體重，以后每3d測量1次。

1.2.3 關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis Index，AI)的計(jì)算致炎后第12天開始觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度，每3d 1次。采用0～4級(jí)關(guān)節(jié)評(píng)分法[9]。0分:無紅腫;1分:小趾關(guān)節(jié)紅腫;2分:趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹;3分:踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4分:包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。把2只后踝關(guān)節(jié)的積分累計(jì)起來，即為每只大鼠的AI，每個(gè)動(dòng)物最大為8分。

1.2.4 血液流變學(xué)的檢測方法 給藥4周后，烏拉坦麻醉下，采用腹主動(dòng)脈方法取血，部分取全血用于血液流變學(xué)指標(biāo)檢測。

紅細(xì)胞壓積測定:用微量毛細(xì)管吸入一定量的全血，高速離心機(jī)12000rpm/min，離心15min，專用計(jì)數(shù)板讀出紅細(xì)胞壓積百分?jǐn)?shù);全血黏度測定:將700μl全血緩慢加入旋轉(zhuǎn)黏度儀測定杯中，37℃預(yù)溫1min，測定 50s－1和 200s－1的全血黏度;血漿黏度測定:200μl血漿吸入毛細(xì)管中，測定37℃時(shí)的血漿黏度;血漿纖維蛋白原(FIB)含量測定:采用Clauss凝固法原理按試劑盒說明書方法在PRECIL C2000-4血凝儀上測定。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重變化

表1 各組大鼠體重的變化(s，n=12)

表1 各組大鼠體重的變化(s，n=12)

注:與正常組比較:*P<0.05;與正常組比較:**P<0.01;與模型組比較:#P<0.05;與模型組比較:##P<0.01(下同)

組別 第1天 第12天 第21天 第30天 第39天0±21.11 402.50±29.29模 型 組 161.92±7.24 255.92±15.31 258.17±28.83** 296.58±36.63* 331.75±41.95*地 塞 米 松 組 162.58±6.54 262.50±15.26 256.75±19.22** 267.75±18.03* 275.58±22.10*##4 ac 高 劑 量 組 162.25±6.12 253.75±21.71 266.17±31.62** 291.16±37.07* 307.83±47.88*4 ac 低 劑 量 組 162.58±5.30 257.50±17.96 272.91±33.75** 300.92±45.33* 326.50±54.56空 白 對(duì) 照 組 164.70±6.51 271.30± 9.33 327.20±12.43 368.2*

第21天模型組、地塞米松組、4ac高劑量組、4ac低劑量組與空白對(duì)照組比較明顯降低(P<0.01);第39天地塞米松組與模型組相比，體重明顯降低(P<0.01)，但4ac高劑量組、4ac低劑量組和模型組相比，沒有顯著性差異。

2.2 大鼠AI變化

第15天與模型組比較，地塞米松組積分明顯降低(P<0.01)，第21天起動(dòng)物關(guān)節(jié)沒有腫脹;第39天和模型組比較，4ac高劑量組積分明顯降低(P<0.01)，而4ac低劑量組則無顯著變化。

2.3 各組動(dòng)物血流變學(xué)指標(biāo)的變化

模型組和空白對(duì)照組相比，紅細(xì)胞壓積、血漿黏度和全血黏度(低切)均明顯增加(P<0.01)，纖維蛋白原含量和全血還原黏度(高切)無顯著性差異;與模型組比較，地塞米松組能明顯降低紅細(xì)胞壓積、全血黏度(高切和低切)和全血還原黏度(高切和低切)(P<0.01);4ac高劑量組能明顯降低紅細(xì)胞壓積、全血黏度和全血還原黏度(P<0.01);4ac低劑量組能明顯降低全血黏度(低切)和全血還原黏度(P<0.01)。

表2 各組大鼠AI的變化(s，n=12)

表2 各組大鼠AI的變化(s，n=12)

組別 第12天 第15天 第21天 第30天 第39天5±2.22地 塞 米 松 組 4.72±2.23 0.62±0.51## 0## 0## 0##4 ac高 劑 量 組 4.78±2.54 4.83±2.82 5.67±2.99 3.83±2.48 2.50±1.57##4 ac低 劑 量 組 4.81±2.78 4.92±2.97 5.25±3.60 5.50±3.50 4.6模 型 組 4.91±2.65 5.25±2.45 5.83±3.38 4.67±3.11 4.2 7±2.99

表3 各組動(dòng)物血流變學(xué)指標(biāo)的改變(s，n=12)

表3 各組動(dòng)物血流變學(xué)指標(biāo)的改變(s，n=12)

組別 紅細(xì)胞壓積(%)纖維蛋白原含量(g/L)血漿黏度(mpa.s)全血黏度(mpa.s)全血還原黏度(mpa.s)50s－1 200s－1 50s－1 200s －1±0.13 14.86±1.53 5.90±0.32模 型 組 49.5±2.50** 3.10±0.34 0.99±0.04** 8.06±1.17** 3.65±0.33* 14.48±2.02 5.45±0.43 DEX 組 45.7±1.97## 3.33±0.40 0.99±0.03 6.11±0.99### 3.15±0.28### 13.88±1.64### 4.92±0.29###4 ac高 劑 量 組 45.23±4.43## 3.55±0.47 0.99±0.04 6.30±1.02### 3.19±0.27### 11.81±1.52### 4.93±0.39###4 ac低 劑 量 組 48.79±1.56 3.38±0.54 0.99±0.05 6.94±0.65### 3.32±0.21### 12.38±1.56### 4.86±0.59空 白 對(duì) 照 組 46.9±2.80 3.1±0.22 0.95±0.03 7.57±0.68 3.57##

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，其病因病機(jī)是人體正氣虛弱，風(fēng)寒濕邪侵襲人體，正氣為邪所阻，導(dǎo)致氣血凝滯，久而成痹?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明[2～4]，RA患者可有微循環(huán)和血液流變學(xué)方面等異常，分析其原因主要與血管內(nèi)膜炎癥及血液黏度增高有關(guān)，這些因素共同作用促成血栓形成，栓塞四肢微小血管，導(dǎo)致RA病人四肢血液循環(huán)障礙的諸項(xiàng)臨床癥狀。目前，CIA模型在臨床表現(xiàn)、病理組織學(xué)及體液免疫反應(yīng)方面與人RA接近，是研究人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他自身免疫性疾病的常用動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)研究表明，CIA模型組動(dòng)物的全血黏度、血小板聚集率、纖維蛋白原參數(shù)均高于空白對(duì)照組，表明有高黏、血瘀存在。

葛根素系異黃酮類，為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd1)Ohwi1或甘葛藤Pueraria thomsonii Bent h.的主要有效成分。研究表明，葛根素對(duì)血液流變學(xué)指標(biāo)具有一定的改善作用。高爾等研究發(fā)現(xiàn)，葛根素對(duì)家兔紅細(xì)胞壓積、全血比黏度、血沉等血液流變學(xué)指標(biāo)有改善作用，能抑制腎上腺素誘導(dǎo)的人和動(dòng)物的血小板聚集。

在本實(shí)驗(yàn)中，表1顯示大鼠體重在第21天，模型組、地塞米松組、4ac高劑量組、4ac低劑量組與空白對(duì)照組比較，體重均有明顯下降，說明造?？梢允勾笫篌w重增長幅度下降。經(jīng)過1個(gè)月的治療，4ac高劑量組已改善了CIA模型大鼠的關(guān)節(jié)腫脹和血液流變學(xué)部分指標(biāo)，但均未對(duì)體重產(chǎn)生明顯影響。

表2顯示，在第15天即給藥3d后，地塞米松組動(dòng)物的關(guān)節(jié)積分較其他各組比較有極顯著性意義，在第39天4ac高劑量組動(dòng)物關(guān)節(jié)積分較模型組也明顯降低。這說明激素對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有較好的治療作用，而4ac高劑量對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)腫脹度也有一定的改善作用。

血液流變學(xué)主要是反映由于血液成分變化而帶來的血液流動(dòng)性、凝滯性和血液黏度的變化，血液流變性質(zhì)的異常，將會(huì)引起機(jī)體血液循環(huán)障礙。本實(shí)驗(yàn)所采用的CIA大鼠的血液流變學(xué)紅細(xì)胞壓積、血漿黏度和全血黏度均明顯高于空白對(duì)照組，纖維蛋白原和全血還原黏度模型組與空白對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)，4ac高、低劑量組均能顯著降低紅細(xì)胞壓積、全血黏度和全血還原黏度。王躍民等報(bào)道，低切變率下的血液黏度與紅細(xì)胞聚集指數(shù)關(guān)系密切，其值的升高常常反映紅細(xì)胞聚集程度較高，紅細(xì)胞變形能力則主要影響高切變率下的全血黏度，高切變率下的全血黏度降低，與紅細(xì)胞變形能力增強(qiáng)有關(guān)。紅細(xì)胞壓積是形成血液黏度的重要因素，血液黏度隨紅細(xì)胞壓積呈指數(shù)變化。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，該藥可能是通過降低CIA大鼠全血黏度和全血還原黏度等作用，來抑制紅細(xì)胞聚集，改變模型大鼠血液“濃、黏、聚、凝”的狀態(tài)，改善血液流變性，4ac對(duì)CIA大鼠血液流變學(xué)部分重要指標(biāo)有明顯改善作用，可能是該藥治療RA的藥理基礎(chǔ)之一。

本文研究表明，4ac高劑量能有效降低動(dòng)物的關(guān)節(jié)腫脹程度，明顯改善血液的高凝狀態(tài)，改善微循環(huán)，提示4ac高劑量對(duì)CIA關(guān)節(jié)炎有一定的治療作用，但其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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