健脾消癌方防止裸鼠大腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的實驗研究*

蔣益蘭，朱克儉，李勇敏，蔡 美，荊 珍

(湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腫瘤科，湖南長沙 410006)

本研究以裸鼠人大腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移模型為研究對象，探索中藥健脾消癌方防止大腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的作用機理，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物制備

健脾消癌方由黨參、薏苡仁、莪術(shù)、石見穿、七葉一枝花等組成，按有關(guān)工藝流程制成濃度為2.1∶1(即1ml水煎劑含2.1g生藥)的水煎劑備用。

1.2 動物及瘤株

BALB/C-nu/nu裸鼠40只，雌雄各半，4～6周齡，在SPF條件下飼養(yǎng)。瘤株采用人結(jié)腸癌細胞株LoVo。

1.3 模型制備

于無菌條件下將裸鼠置于保溫床上，用2.5%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉裸鼠。從腹部左側(cè)2.0cm～2.5cm切口進腹，切斷脾胃韌帶，將脾臟完全顯露于腹腔外。用100μl微量注射器從脾臟上極進針，深度 1.0cm以上，每只裸鼠注入105HCCC(LoVo 細胞)懸液 50μl，注射時間 1min，出針后即用95%酒精稍浸濕的棉球輕壓止血，并殺死可能外滲的腫瘤細胞，5min后結(jié)扎并切斷脾蒂，移除脾臟，3～0絲線單層間斷縫合腹壁。

1.4 分組給藥

隨機選取8只裸鼠按手術(shù)常規(guī)操作，打開腹腔后再縫合，作為假手術(shù)組;其余裸鼠按以上方法制成大腸癌模型，將造模后裸鼠隨機分成模型組、西藥組(5-fu+CF)、中藥組(健脾消癌方)3組，每組8只，雌雄各半。各組于造模后第3天開始給藥，健脾消癌方按42.8g/kg的劑量給藥，灌胃體積為20m1/kg，每天1次，每6d后停1d，共8周;西藥組動物腹腔注射5-Fu和 CF，劑量給藥分別為 0.13g/kg、0.026g/kg。用生理鹽水配制5-Fu和CF的給藥濃度分別為13mg/ml和2.6mg/ml，給藥體積為10ml/kg，每天1次，共5d，第29天再重復1次。

1.5 指標測定

1.5.1 肝轉(zhuǎn)移情況 肉眼觀察:動物死亡后或存活超過60d處死后，迅速打開腹腔，仔細觀察肝臟有無轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)、轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)分布狀況、數(shù)量、大小等，挖出各個轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)并稱癌結(jié)節(jié)和肝臟重量，同時觀察胃、腸、胰、肺等臟器有無轉(zhuǎn)移。形態(tài)學檢查:動物死亡后或處死后，將每只小鼠的部分肝臟和大腸標本以10%福爾馬林固定、石臘包埋切片、HE染色和光鏡觀察。

1.5.2 血清VEGF測定 各組于第4周時，眼眶采血約1ml，采用雙抗體夾心ELISA法，測定血清VEFG濃度。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 肝轉(zhuǎn)移情況的觀察

2.1.1 肉眼觀察

表1 各組肝轉(zhuǎn)移發(fā)生情況

經(jīng)脾內(nèi)接種HCCC細胞后，模型組及中藥、西藥組裸鼠肝臟表面多數(shù)有多發(fā)性轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，中藥、西藥組肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較模型組少，轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)數(shù)、癌重和癌重/肝重，中藥組與模型組比較組間差異均有統(tǒng)計學意義(<0.05)，西藥組與模型組及西藥組與中藥組組間比較無統(tǒng)計學意義。肝表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)主要位于肝葉邊緣和肝葉臟面，胃、大腸、小腸、腸系膜、肺等臟器均未見轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，提示健脾消癌方能抑制裸鼠大腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移。

2.1.2 組織學檢查 光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組及中藥、西藥組肝轉(zhuǎn)移瘤為高、中分化腺癌，癌與肝組織境界清楚，癌巢內(nèi)大片壞死并可見蟲卵鈣化沉積。有癌轉(zhuǎn)移灶的肝臟壞死不明顯，間質(zhì)可見少量炎細胞浸潤。未見癌轉(zhuǎn)移肝臟標本，也可見不同程度的肝組織壞死和肝細胞變性，間質(zhì)內(nèi)見炎細胞浸潤，部分肝膽管周圍重度炎癥，小膽管增生、擴張，纖維組織增生，血管擴張充血，表現(xiàn)為較嚴重的炎癥。

2.2 對裸鼠血清VEGF濃度的影響

由表2可見，造模各組裸鼠血清VEGF濃度均高于假手術(shù)組，但中藥組及西藥組裸鼠血清VEGF濃度均低于模型組，提示健脾消癌方能降低大腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移模型裸鼠血清VEGF水平。

表2 健脾消癌方對大腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移模型裸鼠血清VEGF濃度的影響

3 討論

大腸癌是人類最常見的消化道惡性腫瘤之一。據(jù)有關(guān)資料統(tǒng)計，大腸癌近5年生存率始終在50%左右，有近一半患者術(shù)后出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移，肝轉(zhuǎn)移是大腸癌最常見的嚴重并發(fā)癥。多年來，我們運用健脾消癌方治療大腸癌術(shù)后及中晚期大腸癌患者，均取得較好療效。臨床觀察提示，中藥健脾消癌方配合化療能降低大腸癌術(shù)后的復發(fā)轉(zhuǎn)移，延長生存期，同時改善臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，增強患者的免疫功能，并降低癌胚抗原的含量，具有良好的臨床運用前景。

腫瘤持續(xù)性生長和轉(zhuǎn)移需要新生血管的形成。在腫瘤新生血管形成的影響因素中，最有效和特異的因子就是血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)。研究表明，VEGF除可誘導血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生蛋白水解酶、間質(zhì)膠原酶等促進血管生成外，還可提高血管通透性，促進血漿蛋白、纖維蛋白原外滲導致腫瘤間質(zhì)水腫，為腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移提供條件。許多類型腫瘤患者血液和尿液中存在VEGF，且其水平增加與腫瘤轉(zhuǎn)移率增高和患者預后不良有密切關(guān)系。

本實驗結(jié)果顯示，在組織形態(tài)學方面，各用藥組未見顯著差異。中藥組、西藥組肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較模型組減少，轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)數(shù)目、癌重和癌重/肝重，中藥組與模型組比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義，提示健脾消癌方能抑制裸鼠大腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移。中藥組裸鼠血清VEGF表達低于模型組血清VEGF表達，其差異具有顯著性，可能是健脾消癌方抑制大腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的原因之一。

我國的中藥資源豐富，進一步篩選開發(fā)高效、低毒廣譜的抗轉(zhuǎn)移藥大有可為。腫瘤轉(zhuǎn)移的機制頗為復雜，中藥抗轉(zhuǎn)移的研究還需要從不同方面、不同層次、多個靶點來進行。相信在今后的研究中，中藥抗腫瘤轉(zhuǎn)移的研究將會取得較大的進展。