肝細胞生長因子對糖尿病腎病不同階段的治療作用

孫喜明,李 興,王桂英,田立華,張慧榮

糖尿病腎病已成為糖尿病患者死亡的主要原因,轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)和結(jié)締組織生長因子(CTGF)在糖尿病腎病發(fā)病機制中起著重要作用,使細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白表達增多并抑制其降解。肝細胞生長因子(HGF)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種腎營養(yǎng)因子。但HGF在糖尿病腎病中的作用仍是有爭議的。本研究給予2型糖尿病腎病大鼠腹腔注射重組肝細胞生長因子 ,利用RT-PCR檢測腎臟TGF-β1mRNA、CTGFmRNA、c-metmRNA表達和病理變化,觀察HGF對2型糖尿病腎病不同階段的治療作用。

1 材料與方法

1.1 模型建立 4周～8周的雄性Wistar大鼠60只,體重220 g～250 g,隨機分為對照組(NC組)、糖尿病腎病組(DN組)、治療組(HGF組)。NC組和DN組大鼠 36只,喂以高糖、高脂飼料2月后,腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ,由 Sigma公司提供),30 mg/kg。1月后,空腹血糖≥7.0 mmol/L,確定為2型糖尿病大鼠。HGF組共12只,糖尿病鼠成模后2個月,隨機取6只給予HGF 500 μ g/(kg?d),皮下注射,連續(xù)1個月,隨后處死;另外6只于糖尿病鼠成模后6個月,給予hHGF 500 μ g/(kg?d),皮下注射,連續(xù)1個月,隨后處死。DN組:共24只,分別于糖尿病鼠成模后2個月、3個月、6個月、7個月后,隨機取6只處死;對照組24只,喂以低糖、低脂飲食,隨機取6只,分別與DN組同時處死。

1.2 血糖與尿蛋白的測定 每周測血糖1次。分別于注射后2個月、3個月、6個月和7個月在代謝籠中收集尿液,測定 24 h尿白蛋白排泄率。

1.3 TGF-β1mRNA、CTGFmRNA、c-metmRNA 的表達 應(yīng)用RT-PCD檢測,引物序列由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。經(jīng)紫外凝膠圖像分析儀進行數(shù)據(jù)分析,以目的基因mRNA擴增后產(chǎn)物的光密度值與GAPDHmRNA擴增后產(chǎn)物光密度值的比值作為目的基因mRNA表達的相對值。

1.4 病理觀察 常規(guī)HE染色,在JEOL-100型透射電鏡下觀察腎小球基膜的改變。光鏡下用M IAS-2000圖像分析綜合系統(tǒng)(四川大學(xué)圖像圖形研究所)測定腎小球體積。電鏡照片亦采用該系統(tǒng)測定腎小球基膜平均厚度(GBM T)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖變化 HGF組和DN組大鼠在注射STZ1個月后,空腹血糖≥7.0 mmol/L,且各組大鼠組間及不同時間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 各組大鼠尿白蛋白(Alb)的變化 HGF組和DN組大鼠于注射STZ2個月后尿白蛋白與對照組相比明顯增加(P＜0.05),與人早期糖尿病腎病相似。3個月時,HGF組尿白蛋白無明顯變化,但DN組尿白蛋白明顯增加(P＜0.05);6個月時,HGF組和DN組出現(xiàn)大量的蛋白尿,與人臨床糖尿病腎病相似,且HGF組與DN組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義;7個月時,HGF組尿白蛋白較6個月時尿蛋白明顯減少,而DN組尿蛋白較6個月時明顯增加(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠24 h尿白蛋白排泄率(±s)mg

表1 各組大鼠24 h尿白蛋白排泄率(±s)mg

組別 n 高熱量飲食2個月 注射STZ1月 注射STZ2月 注射STZ3月 注射STZ6月 注射STZ7月對照組 6 3.88±0.78 4.60±0.59 4.58±0.58 4.68±0.54 4.64±0.62 4.76±0.68 DN 組 6 3.85±0.87 5.08±0.24 12.76±6.251) 17.26±0.72 24.24±1.081) 28.35±0.861)HGF組 6 3.89±0.83 4.73±0.70 13.65±3.581) 13.98±0.651)2) 25.23±0.581) 18.86±0.461)2)與對照組比較,1)P＜0.01;與DN組比較,2)P＜0.01

2.3 各組大鼠腎臟的病理變化 DN組大鼠2月時腎小球肥大,腎小球基膜和系膜基質(zhì)輕度增加,可見少量的荒廢腎小球;3個月時,DN組大鼠腎小球基膜和系膜基質(zhì)進一步增厚,荒廢的腎小球進一步增加,而HGF組大鼠腎小球基膜和系膜基質(zhì)未見明顯進一步增厚,荒廢的腎小球未見明顯增加。DN組大鼠6個月時GBM明顯增厚,系膜基質(zhì)明顯增寬,可見大量荒廢的腎小球,殘余腎小球代償性肥大;7個月時,DN組大鼠腎小球基膜和系膜基質(zhì)進一步增厚,荒廢的腎小球進一步增加,而HGF組大鼠腎小球基膜和系膜基質(zhì)厚度較6個月時明顯減輕,荒廢的腎小球數(shù)量明顯減少。詳見表2。

表2 各階段腎臟病理形態(tài)學(xué)的變化(±s)

表2 各階段腎臟病理形態(tài)學(xué)的變化(±s)

時段 腎小球體積V(μ m3)腎小球基膜厚度GBM T(μ m)對照組 DN組 HGF組 對照組 DN組 HGF組高熱量飲食2月 323±34 321±50 4 362±366 4 366±362注射STZ1月 320±31 367±351)注射STZ2月 299±30 402±292)4 604±1396 7 480±1 4661)注射 STZ3月 332±56 275±252) 389±652)4) 4 615±1 325 9 886±1 1382) 7 639±1 2371)2)3)注射 STZ6月 339±36 254±382) 4 357±1 021 1 1297±1 6892)注射 STZ7月 325±45 198±342) 279±331)4) 4 126±986 1 3867±1 6892) 8 565±1 3232)4)5)與對照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與DN組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01;與DN組治療前比較,5)P＜0.05

2.4 各組大鼠 TGF-β1,c-met及 CTGF mRNA的表達變化在3個月時,DN組 TGF-β1及CTGFmRNA表達較對照組及HGF組和 DN組 2個月時高。在 6個月時,DN組 c-met mRNA表達較3個月和2個月時進一步降低,TGF-β1及CTGFmRNA表達較3個月和2個月時顯著增高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在7個月時,HGF組 c-met mRNA表達較DN組6個月及7個月時高,TGF-β1及CTGFmRNA表達較DN組6個月及7個月時低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。詳見圖 1、圖 2、圖 3。

圖3 各組大鼠c-met mRNA的表達

3 討 論

糖尿病腎病的典型病理改變是腎小球硬化,而尿白蛋白是反映腎小球功能的主要指標(biāo)。本研究建立糖尿病及2型糖尿病腎病大鼠模型。糖尿病大鼠2個月時,DN組和HGF組尿白蛋白排泄率(UAER)顯著高于對照組,腎小球肥大,腎小球基膜和系膜基質(zhì)輕度增厚,與人早期糖尿病腎病的發(fā)病相似。糖尿病大鼠6個月時出現(xiàn)大量蛋白尿,為非選擇性蛋白尿,GBM明顯增厚,系膜基質(zhì)增寬,荒廢的腎小球增多,殘余腎小球代償性肥大,與人臨床糖尿病腎病相似。

大量實驗研究表明,DN的發(fā)病實際上是多種細胞因子、生長因子及激素等對過高血糖的綜合反映結(jié)果。生長因子如TGF-β1和CTGF在DN發(fā)病機制中起著重要作用,這些生長因子使細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白表達增多并抑制其降解[1],而ECM在腎小球的異常沉積是引起腎小球硬化的主要原因之一。高血糖、糖化終末產(chǎn)物和血管緊張素Ⅱ產(chǎn)生活性氧物質(zhì)并刺激TGF-β1上調(diào),TGF-β1反過來上調(diào) CTGF的表達,也誘發(fā)高血糖。高血糖誘發(fā)了腎臟一系列事件,最終導(dǎo)致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化[2]。腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化是各種原因所致腎臟疾病進行性損害直至腎衰的最后共同通路。腎小球或腎小管間質(zhì)損傷,炎性細胞侵入,促進纖維化的因子(TGF-β1、CTGF)生成增加,抑制纖維化的因子(HGF)生成減少,成肌纖維細胞形成及增殖,ECM積聚。在眾多促纖維化的因子中,TGF-β1被認為是最重要的促纖維化因子之一,它在腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化中扮演著極為重要的角色[3]。本實驗觀察到,糖尿病大鼠在3個月時,腎組織TGF-β1mRNA表達明顯增高,同時蛋白尿進一步增加,并且隨著時間的延長,TGF-β1mRNA的表達進一步增強,尿蛋白進一步增多,GBM和腎小球系膜進一步增厚。

CTGF曾被認為在纖維化過程中是TGF-β的下游調(diào)控因子[4]。然而,CTGF可不依賴TGF-β被誘導(dǎo)表達增高,大量研究表明高糖環(huán)境下,CTGF在腎小球膜細胞表達增加,導(dǎo)致ECM沉積[5]。CTGF在包括糖尿病腎病在內(nèi)的多種腎病的腎臟纖維化中過度表達[1]。本實驗觀察到,糖尿病大鼠在3個月時,CTGFmRNA表達明顯增高,并且隨著時間的延長,CTGFmRNA的表達進一步增強,GBM和腎小球系膜進一步增厚,即:CTGFmRNA的表達與糖尿病腎病腎臟纖維化密切相關(guān)。CTGF和 TGF-β1使ECM 蛋白表達增多并抑制其降解,造成細胞肥大,最終導(dǎo)致腎臟纖維化。

HGF是近年來發(fā)現(xiàn)的一種腎營養(yǎng)因子。HGF是間質(zhì)來源的多效性生長因子,在多種慢性腎病中具有抗纖維化和促進再生的功能。HGF的作用是由其受體c-met介導(dǎo)的,c-met屬于氨酸激酶受體超家族[6]。

在急性和慢性腎衰的情況下,HGF通過促進細胞的生長、促進實質(zhì)細胞中間質(zhì)結(jié)構(gòu)的有序化來參與損傷和纖維化后腎組織的重修和再生,發(fā)揮其預(yù)防和治療的作用[7]。因此,補充給予HGF以降低TGF-β和CTGF水平從而治療腎纖維化和慢性腎衰。本實驗給予早期糖尿病腎病大鼠HGF治療,抑制了TGF-β1和CTGFmRNA表達的上調(diào),雖然早期糖尿病大鼠腎臟的形態(tài)和功能未見明顯改善,但是早期糖尿病大鼠的尿蛋白未見明顯增加、GBM和系膜基質(zhì)未見進一步增厚;這可能與TGF-β1破壞腎小球濾過膜的電荷屏障及分子屏障,而此時腎臟纖維化較輕有關(guān);因而HGF可抑制早期糖尿病腎病的進一步發(fā)展。

在糖尿病腎病的治療中,HGF可通過上調(diào)c-metmRNA的表達,抑制TGF-β1和 CTGF等致纖維化生長因子的作用的途徑來抑制糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化,而起到保護腎結(jié)構(gòu)和維護腎功能的作用,具有良好的臨床應(yīng)用前景。

[1]Wang S,DeNichilo M,Brabaker C,et al.Connective tissue g rowth factor in tubulointerstitial injury of diabetic nephropathy[J].Kidney Int,2001,61:96-105.

[2]Manson RM,Wahab NA.Extracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy.[J]Am Soc Nephrol,2002,14:1358-1373.

[3]Strutz F,Zeisberg M,Renziehausen A,et al.TGF-β1induces proliferation in human renal fibroblasts via induction of basic fibroblast growth factor(FGF-2)[J].Kidney Int,2001,59(2):579-592.

[4]Flyvbjer A.Putative pathophy siological role of g rowth factors and cytokines in experimental diabetic kidney disease[J].Diabetologia,2000,43:1205-1223.

[5]Twigg SM,Chen MM,Joly AH,et al.Advanced glycosylation end products up-regulate connective tissue g rowth factor in human fibroblasts:A potential mechanism for expansion of ex tracellular matrix in diabetes mellitus[J].Endocrinology,2001,142:1760-1769.

[6]Matsumoto K,Nakamura T.Hepatocy te g rowth factor:Renotropic role and potential therapeutics for renal disease[J].Kidney Int,2001,59:2023-2038.

[7]Mizuno S,Kurosawa T,Matsumoto K,et al.Hepatocyte g rowth factor prevents renal fibrosis and dysfunction in a mouse model of chronic renal disease[J].Clin Invest,1998,101:1827-1834.