體外免疫原快速激活全血細胞固有免疫反應系統(tǒng)模式的應用

郭峰，錢寶華，花美仙

血液循環(huán)的血液固有免疫系統(tǒng)由血漿補體固有免疫子系統(tǒng)、紅細胞固有免疫子系統(tǒng)、血小板固有免疫子系統(tǒng)和白細胞固有免疫子系統(tǒng)構(gòu)成[1]。若采用系統(tǒng)生物學的復雜理論和數(shù)學公式計算探討這些子系統(tǒng)之間的網(wǎng)絡關(guān)系，則必須通過在體外建立系統(tǒng)模式進行系統(tǒng)免疫學實驗研究[2]。根據(jù)研究目的不同，設(shè)計不同的系統(tǒng)模式，我們已建立了相關(guān)體外系統(tǒng)模式[3-4]，并朝著計算免疫學方向發(fā)展，在卡介苗治療腫瘤的免疫以及中藥多糖等生物免疫調(diào)節(jié)劑作用機制研究等[5]多方面有所應用，我們在紅細胞固有免疫活性研究的基礎(chǔ)上，逐步發(fā)展與形成系統(tǒng)血液固有免疫學的新概念，發(fā)現(xiàn)所有血細胞都具有固有免疫活性，可在體外用免疫原激活系統(tǒng)血液固有免疫反應，體外系統(tǒng)實驗免疫模式的建立，為系統(tǒng)免疫學提供了嶄新的研究方法，為尋找炎癥免疫反應中關(guān)鍵免疫分子帶來了新的希望。下面為有關(guān)系統(tǒng)血液免疫反應網(wǎng)絡關(guān)系的初步應用實驗。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

枸櫞酸抗凝新鮮血來自長海醫(yī)院血站 10 例青壯年獻血人員；IL-6、IL-10、IL-12 免疫酶聯(lián)試劑盒購于上海茂元公司；C4 抗血清購于美國 DADE Behring 公司；鼠抗人 CD35-單抗購于丹麥 DAKO 公司；FITC 標記羊抗鼠 IgG 購自上海華美生物有限公司；FITC 標記鼠抗人CD55-單抗和 PE 標記鼠抗人 CD59-單抗購于美國 BD 公司。BD-Facscan 型流式細胞儀為美國 BD 公司產(chǎn)品；DADE Behring BNProspec 速率散射比濁法測定儀購于美國DADE Behring 公司。

1.2 方法

1.2.1 全血細胞懸液制備 將 3 ml 新鮮枸櫞酸抗凝新鮮血 2500 r/min，離心半徑 20cm，離心 5min 后取上層血漿至另一試管（含血小板的血漿）中。在原試管中用生理鹽水恢復血細胞沉淀為原體積 3 ml，混勻后為全血細胞懸液（含紅細胞和所有血細胞）。

1.2.2 白細胞懸液制備 采用冰水破壞法[4]，取 2 支 10 ml試管，取 0.2 ml 全血細胞懸液，加蒸餾水 4 ml 混勻，在冰水中輕輕吹打 1min，然后用高滲鹽水（含氯化鈉 1.8%）4 ml 混勻，再加生理鹽水至滿，2500 r/min，離心半徑 20cm，3min 離心，棄上清液即得 0.2 ml 白細胞懸液（其中白細胞數(shù)量與全血細胞懸液中白細胞數(shù)量相同）。

1.2.3 S180 癌細胞激活全血細胞與白細胞固有免疫反應 每個待測新鮮標本（靜脈采血后 2 h 之內(nèi)）都設(shè)立免疫原激活全血組（自然實驗組）、生理鹽水全血對照組（自然對照組）、免疫原激活白細胞組（分離實驗組）和生理鹽水白細胞對照組（分離對照組），血細胞免疫活性采用異種腫瘤細胞抗原，免疫原性極強的滅活小鼠的艾氏腹水癌細胞懸液（S180株，濃度 5×106個/ml）按表1 及下述方法快速激活血細胞的固有免疫活性。

具體設(shè)計見表1。

表1 免疫原 S180 癌細胞激活全血細胞和白細胞成分配表

按表1 分配的 4 組，分別混勻后，置于 37℃水浴箱溫育 1 h，2500 r/min，離心半徑 20cm，離心 5min 后，取上清液置于 1 ml 塑料離心管中，–20℃冰凍保存，集中同批按 IL-6、IL-10 免疫酶聯(lián)試劑盒說明書常規(guī)程序測定，免疫原對 IL-6 或 IL-10 的激活率與紅細胞對 IL-6 或IL-10 的吸附率按下述公式計算。

免疫原激活率 = 實驗組 － 相應對照組含量/相應對照組含量

紅細胞吸附率 = 分離對照組（或?qū)嶒灲M）－ 自然對照組（或?qū)嶒灲M）/分離對照組（或?qū)嶒灲M）

1.2.4 大腸桿菌激活全血細胞固有免疫反應 實驗按表2 分配表設(shè)計，分為免疫原激活全血組（自然實驗組）和生理鹽水全血對照組（自然對照組）。使用 BNProspec 速率散射比濁法測定儀常規(guī)測定反應液中補體 C4 含量。沉淀血細胞分別采用抗紅細胞 CD35 單抗間接免疫熒光法[1]，抗紅細胞 CD59 單抗直接免疫熒光法[5]，抗淋巴細胞 CD25單抗直接免疫熒光法[5]，使用流式細胞儀測定紅細胞CD35、CD59 以及淋巴細胞 CD25 分子表達量的變化。

表2 大腸桿菌免疫原激活全血細胞成分配表

按表2 分配的 2 組管混勻后置于 37℃水浴箱溫育1 h 后，2500 r/min，離心半徑 20cm，離心 5min 后，取上清液置于 5 ml 塑料離心管中，–20℃冰凍保存，集中同批按 IL-10、IL-12 免疫酶聯(lián)試劑盒說明書常規(guī)程序測定；沉淀為全血細胞可測定各種血細胞的免疫分子，采用 CD59熒光標記單抗直接測定法[5]，常規(guī)操作，加 PE 標記鼠抗人CD59 抗體暗箱作用 20min 后，磷酸緩沖液（pH 7.2）洗滌 2 次，流式細胞儀測定紅細胞平均熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS10.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計，分析不同組之間差異，計量資料采用t檢驗，求t值和P值，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 S180 癌細胞激活全血細胞與白細胞固有免疫反應

研究表明 S180 異種腫瘤細胞可激活白細胞使其分泌IL-6 和 IL-10（表3、4）。

表3 紅細胞在 S180 異種腫瘤細胞激活人血細胞免疫活性中對 IL-6 的調(diào)控作用（±s）

表3 紅細胞在 S180 異種腫瘤細胞激活人血細胞免疫活性中對 IL-6 的調(diào)控作用（±s）

注：a與生理鹽水全血對照組相比，t = 11.647，P＜0.01；b與生理鹽水白細胞對照組相比，t = 6.7567，P＜0.01；c與生理鹽水白細胞對照組相比，t = 3.997，P＜0.05；d與生理鹽水白細胞對照組相比，t = 4.3495，P＜0.01；e與生理鹽水全血對照組吸附率相比，t = 2.3798，P＜0.05

組別 例數(shù)（n）IL-6（pg/ml）免疫原激活率紅細胞吸附率免疫原激活全血組 10 3.61±0.52a, b 0.21±0.14 0.35±0.08e生理鹽水全血對照組 10 3.00±0.53c免疫原激活白細胞組 10 5.56±0.75d 0.37±0.22 0.27±0.07生理鹽水白細胞對照組 10 4.13±0.72

表4 紅細胞在 S180 異種腫瘤細胞激活人血細胞免疫活性中對 IL-10 的調(diào)控作用（±s）

表4 紅細胞在 S180 異種腫瘤細胞激活人血細胞免疫活性中對 IL-10 的調(diào)控作用（±s）

注：a與生理鹽水全血對照組相比，t = 5.3129，P＜0.01；b與免疫原激活白細胞組相比，t = 3.5631，P＜0.01；c與生理鹽水白細胞對照組相比，t = 4.358，P＜0.01；d與生理鹽水白細胞對照組相比，t = 5.481，P＜0.01；e與白細胞分離組激活率相比，t = 2.811，P＜0.05；f與生理鹽水全血對照組吸附率相比，t = 2.7439，P＜0.05

組別 例數(shù)（n）IL-10（pg/ml）免疫原激活率紅細胞吸附率免疫原激活全血組 10 6.24±0.58a, b 0.29±0.11e –0.20±0.12f生理鹽水全血對照組 10 4.85±0.59c –0.36±0.14免疫原激活白細胞組 10 5.25±0.66d 0.47±0.17生理鹽水白細胞對照組 10 3.62±0.67

S180 異種腫瘤細胞激活系統(tǒng)血液固有免疫反應中補體C4 含量、紅細胞 CD35、CD59、淋巴細胞 CD25 表達量的變化規(guī)律見表5。

表5 S180 異種腫瘤細胞激活人血細胞固有免疫活性中紅細胞CD35、CD59、淋巴細胞 CD25 表達量比較（±s）

表5 S180 異種腫瘤細胞激活人血細胞固有免疫活性中紅細胞CD35、CD59、淋巴細胞 CD25 表達量比較（±s）

注：a與生理鹽水全血對照組相比，t = 2.2360，P＜0.05；b與生理鹽水全血對照組相比，t = 2.5979，P＜0.05；c與生理鹽水全血對照組相比，t =2.424，P＜0.05；d與生理鹽水全血對照組相比，t = 27.9498，P＜0.01

組別 例數(shù)（n） 補體 C4 紅細胞 CD35 平均熒光強度 紅細胞 CD59 平均熒光強度 淋巴細胞 CD25 平均熒光強度免疫原激活全血組 10 0.06±0.01a 28.65±8.08b 118.12±24.74c 37.29±3.00d生理鹽水全血對照組 10 0.05±0.01 40.21±11.52 88.35±29.93 5.28±1.78

2.2 大腸桿菌激活全血細胞固有免疫反應

大腸桿菌進入血液后可使紅細胞 CD59 分子的表達量明顯上升，使白細胞分泌抑炎細胞因子 IL-10和促炎細胞因子 IL-12 的量都明顯上升（表6，P＜0.05），且達到一個新高度的平衡點。

3 討論

3.1 紅細胞負調(diào)節(jié)白細胞分泌促炎細胞因子 IL-6，而正調(diào)控抑炎細胞因子 IL-10

含有紅細胞的免疫原激活全血組 S180 激活白細胞分泌 IL-6 和 IL-10 的免疫原激活率與免疫原激活白細胞組的免疫原激活率相比，前組都明顯低于后組，結(jié)果表明紅細胞的存在，有緩沖免疫原對白細胞激活的負調(diào)節(jié)作用。從紅細胞對細胞因子的吸附率比較分析，發(fā)現(xiàn)在 S180 細胞激活全血組的 IL-6 吸附率明顯高于無 S180 細胞激活的生理鹽水全血對照組的紅細胞對 IL-6 的吸附率，說明在致病原存在的情況下，在血液循環(huán)引發(fā)的免疫炎癥反應中，紅細胞對 IL-6 吸附調(diào)節(jié)作用增強，使血液中免疫原激活后的白細胞分泌 IL-6 含量明顯下降，可減輕血循環(huán)中的免疫炎癥反應[6-7]。從紅細胞 IL-10 的吸附率分析，發(fā)現(xiàn)吸附率都為負值，說明紅細胞的存在可增強白細胞分泌抑炎因子 IL-10，使白細胞的免疫反應得到適度的控制，而在 S180 細胞激活的全血組，紅細胞對 IL-10 的吸附率負值數(shù)明顯小于無S180 細胞的生理鹽水全血對照組，說明在致病原引發(fā)的血液免疫炎癥反應時，紅細胞增強白細胞分泌抑炎因子 IL-10的作用明顯下降，這有利于消滅致病原的免疫炎癥反應，這還表明在沒有病原體進入血液循環(huán)的狀態(tài)下，紅細胞正調(diào)控白細胞分泌 IL-10 的能力明顯增強，使血循環(huán)免疫反應處在休止狀態(tài)，有利于機體血液循環(huán)生理功能的平衡發(fā)揮。紅細胞對促炎因子 IL-6 和抑炎因子 IL-10 調(diào)節(jié)的有關(guān)具體機制值得進一步深入研究。

表6 大腸桿菌激活人血細胞固有免疫活性中紅細胞CD59 分子與白細胞分泌 IL-10、IL-12 的比較（±s）

表6 大腸桿菌激活人血細胞固有免疫活性中紅細胞CD59 分子與白細胞分泌 IL-10、IL-12 的比較（±s）

注：a與生理鹽水全血對照組相比，t = 2.5066，P＜0.05；b與生理鹽水全血組相比，t = 3.883，P＜0.01；c與生理鹽水全血對照組相比，t = 2.634，P＜0.05

組別 例數(shù)（n）紅細胞 CD59平均熒光強度IL-10（pg/ml）IL-12（pg/ml）免疫原激活全血組 10 451.70±29.50a 8.05±1.27b 1.856±0.751c生理鹽水全血對照組 10 416.52±33.16 6.08±0.98 1.191±0.274

3.2 免疫原可激活系統(tǒng)血液快速固有免疫反應，而紅細胞起著傳遞信息的主干道作用

從表5的結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)免疫原（艾氏腹水癌 S180 等）可激活補體固有免疫子系統(tǒng)、紅細胞固有免疫子系統(tǒng)和白細胞免疫子系統(tǒng)，這是系統(tǒng)血液快速固有免疫反應，免疫原激活補體系統(tǒng)使補體 C4 含量明顯上升，而紅細胞 CD35 分子表達量明顯下降。CD35 分子表達量下降，很可能是補體C3b、C4b 分子調(diào)理的免疫原黏附到紅細胞 CD35（CR1）分子，抗 CD35 單抗對紅細胞 CD35 結(jié)合量減少所致，而紅細胞 CD59 分子表達量明顯上升，與免疫原（S180）激活相關(guān)。淋巴細胞 CD25 表達量升高也與免疫原激活 T 淋巴細胞和 NK 細胞 CD25 分子活性有關(guān)。CD25 是 IL-2受體 α 鏈，而紅細胞 CD59 分子是 T 淋巴細胞和 NK 細胞 CD2 的配體，結(jié)果表明，經(jīng)補體調(diào)理的抗原被紅細胞CD35 黏附處理后，使紅細胞 CD59 分子活化表達量增加，與淋巴細胞 CD2 結(jié)合量增加，可使淋巴細胞活化程度增強，表現(xiàn)在 CD25 分子表達量明顯增加[5]，調(diào)控 IL-2 等細胞因子的平衡能力明顯增強。本次研究結(jié)果與前面研究[5]，結(jié)果是吻合的。免疫原進入血液循環(huán)后，首先激活補體固有免疫子系統(tǒng)，而后 85%被補體調(diào)理過的免疫原黏附到紅細胞 CD35 分子[2]，并激活紅細胞 CD59 分子的活性和使其表達量增加，而紅細胞 CD59 與淋巴細胞 CD2 結(jié)合量增加，激活淋巴細胞免疫活性，使淋巴細胞 CD25 分子表達量增加，紅細胞對白細胞分泌 IL-2、IL-6、IL-10 的調(diào)控能力明顯增加。紅細胞對白細胞免疫炎癥反應有緩沖與平衡作用，在系統(tǒng)血液免疫反應中具有重要的傳遞信息，調(diào)控與平衡白細胞免疫反應網(wǎng)絡的重要作用。我們認為在系統(tǒng)血液免疫反應中存在一個傳遞免疫信息的紅細胞固有免疫反應的主干道，這就是現(xiàn)代系統(tǒng)血液免疫學研究中的重要理論與假設(shè)[5]。說明血行感染體外實驗免疫研究中，也可利用我們構(gòu)建的免疫原快速激活全血細胞免疫活性的測定法，探討感染的重要固有免疫細胞和分子以及關(guān)鍵機制的研究。可以認為紅細胞補體受體和補體調(diào)節(jié)蛋白在調(diào)控免疫炎癥反應中具有重要的關(guān)鍵分子的作用[3,6]。用現(xiàn)代系統(tǒng)血液固有免疫學的新概念去研究抗感染固有免疫炎癥反應的關(guān)鍵調(diào)控機制會有新的發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)新點成果展現(xiàn)。

3.3 紅細胞 CD35 和 CD59 分子是抗血行感染的重要固有免疫分子

IL-10 主要由 Th2 細胞產(chǎn)生，能抑制 Th1 細胞釋放細胞因子（IFN-Y 和 IL-2 等），IL-12 主要由具有抗原提呈功能的細胞（如樹突狀細胞和巨噬細胞等）產(chǎn)生，活化的單核細胞是血液中 IL-6 主要來源，T 細胞、B 細胞，都能在不同條件下產(chǎn)生 IL-6[8]。因此本文介紹的研究結(jié)果也表明紅細胞在調(diào)控各種白細胞的免疫炎癥反應網(wǎng)絡關(guān)系中具有非常重要的作用，是血液中白細胞固有免疫炎癥反應調(diào)控的重要固有免疫細胞，紅細胞 CD35 與 CD59 分子是白細胞抗感染免疫炎癥反應調(diào)控中的重要固有免疫分子，值得深入研究。

總之，系統(tǒng)血液固有免疫學是嶄新的研究領(lǐng)域，也是現(xiàn)代系統(tǒng)免疫學重要的研究方向之一[9-10]。現(xiàn)代系統(tǒng)血液固有免疫學新概念的提出，打破了原有的僅僅研究各種白細胞免疫功能之間網(wǎng)絡關(guān)系的系統(tǒng)免疫學研究的局限，采用系統(tǒng)生物學思路去研究各種白細胞免疫功能與其他血細胞免疫活性以及體液物質(zhì)（包括補體、酶、激素、酯類等）之間的網(wǎng)絡關(guān)系[11-12]。而系統(tǒng)血液固有免疫學研究是現(xiàn)代系統(tǒng)免疫學的重要研究窗口[7]，可尋找新的突破點。我們創(chuàng)建的免疫原快速激活全血細胞免疫活性的體外系統(tǒng)模式測定方法系列，可廣泛應用在系統(tǒng)血液固有免疫學研究領(lǐng)域中，逐步弄清血漿補體固有免疫子系統(tǒng)、紅細胞固有免疫子系統(tǒng)、血小板固有免疫子系統(tǒng)與白細胞固有免疫子系統(tǒng)之間的網(wǎng)絡機制[3]。我們提出的紅細胞固有免疫主干道理論與體外系統(tǒng)模式研究方法，為現(xiàn)代系統(tǒng)血液固有免疫學研究提供了扎實的方法與理論基礎(chǔ)，具有實用價值[13-15]；為機體血循環(huán)中復雜的系統(tǒng)固有免疫炎癥反應的機制研究，提供了扎實的體外實驗系統(tǒng)模式與方法；為尋找血循環(huán)中固有免疫炎癥反應中重要免疫細胞和分子以及關(guān)鍵機制提供了簡便可行的研究思路和實驗研究體系。今后應完善系統(tǒng)固有血液免疫學研究的各種科學設(shè)計與公式，探討和設(shè)計各種合理的數(shù)學公式計算，進一步為我國現(xiàn)代系統(tǒng)固有血液免疫學研究深入發(fā)展與推廣，做出更好的奉獻[1,16]。

志謝本院實驗診斷科張樂之主任技師、張軍博士、張微微技師在免疫酶聯(lián)與流式細胞儀測定技術(shù)工作中給予幫助，在此深表謝意。

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