大腸桿菌hCG核酸疫苗質(zhì)粒擴(kuò)增營(yíng)養(yǎng)條件研究

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(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

核酸疫苗即DNA疫苗，是將編碼的保護(hù)性抗原基因構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒直接導(dǎo)入動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)，使外源基因通過(guò)機(jī)體內(nèi)源性表達(dá)系統(tǒng)并提呈給免疫系統(tǒng)，誘發(fā)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。由于質(zhì)粒DNA傳遞系統(tǒng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率比較低，估計(jì)提供給細(xì)胞的每1000個(gè)質(zhì)粒分子只有1個(gè)能到達(dá)細(xì)胞核并被表達(dá)，導(dǎo)致徹底治愈疾病需要大量的質(zhì)粒DNA,因此，隨著核酸疫苗進(jìn)入臨床研究，必須開(kāi)發(fā)質(zhì)粒DNA的大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)。

質(zhì)粒DNA生產(chǎn)的工藝流程包括質(zhì)粒DNA的構(gòu)建、工程菌發(fā)酵、菌體收集、細(xì)菌裂解、純化濃縮、質(zhì)量檢驗(yàn)與包裝等，其中重組工程菌的發(fā)酵和質(zhì)粒DNA的純化是影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?，F(xiàn)階段對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的研究方向主要集中在培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面，例如，O′Kennedy等[1，2]研究了培養(yǎng)基對(duì)質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，同時(shí)就不同發(fā)酵策略對(duì)質(zhì)粒產(chǎn)量的影響進(jìn)行了研究。但是，如以這些研究結(jié)果作為本發(fā)酵過(guò)程的操作依據(jù)，并不能解決由不同質(zhì)粒、不同菌種造成的過(guò)程特殊性問(wèn)題。為此，作者針對(duì)含有質(zhì)粒pVAXON-hCGβ的大腸桿菌DH5α系統(tǒng)，采用搖瓶實(shí)驗(yàn)考察了碳源、C/N比對(duì)質(zhì)粒DNA含量的影響，并從代謝途徑方面考察了糖酵解途徑抑制劑對(duì)質(zhì)粒DNA含量的影響,初步確立了腫瘤核酸疫苗的大腸桿菌發(fā)酵的優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)條件。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α菌株由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。質(zhì)粒為在pVAX-1的基礎(chǔ)上構(gòu)建的質(zhì)粒pVAXON-hCGβ，攜帶有ON33寡核苷酸，大小為3.7 kb，具有硫酸卡那霉素抗性。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母浸出粉5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母浸出粉5 g·L-1， NaCl 10 g·L-1，瓊脂粉2%(質(zhì)量比)。

PDM培養(yǎng)基：胰蛋白胨7.93 g·L-1，酵母浸出粉4.41 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 17.096 g·L-1，KH2PO43.00 g·L-1，NH4Cl 0.5 g·L-1，MgSO40.24 g·L-1。

改良的PDM培養(yǎng)基：胰蛋白胨7.93 g·L-1，酵母浸出粉4.41 g·L-1，甘油10 g·L-1，Na2HPO4·7H2O 20.5152 g·L-1，KH2PO43.6 g·L-1，NH4Cl 2.68 g·L-1，MgSO40.24 g·L-1。使用時(shí)加入50 μg·mL-1硫酸卡那霉素。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

取-80℃保存的甘油管菌種涂板于含50 μg·mL-1硫酸卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)36 h，挑取單菌落接入50 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃、250 r·min-1培養(yǎng)10 h。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子液以1%(體積比)的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL錐形瓶中裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基及50 μg·mL-1硫酸卡那霉素)，37℃、250 r·min-1培養(yǎng)10 h。

1.3 分析方法

1.3.1 細(xì)胞密度測(cè)定

菌體濃度稀釋至OD600=0.1～0.6(d=1 cm)，用分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)細(xì)胞密度。

1.3.2 菌體干重(DCW)測(cè)量

用預(yù)先稱重的離心管取一定體積發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心10 min，棄去上清，用去離子水重新懸浮細(xì)胞，10 000 r·min-1離心10 min，棄去上清，于110℃的烘箱內(nèi)烘干，經(jīng)3次稱重，恒重后得到菌體干重。

1.3.3 質(zhì)粒產(chǎn)量的測(cè)定

稱取一定量離心后的濕菌體，用Omega公司提供的質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，吸取800 μL經(jīng)試劑盒抽提得到的質(zhì)粒DNA溶液，加水3 mL，轉(zhuǎn)入石英比色皿中測(cè)A260和A280，以A260乘以50得出純化后質(zhì)粒DNA的含量( mg·L-1)，質(zhì)?？截悢?shù)由單位菌體質(zhì)粒含量(mg質(zhì)粒/g菌體干重，記為mg·g-1)衡量[3]。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響

碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成非常重要，由于菌種所含的酶系統(tǒng)不完全一樣，各類(lèi)菌種對(duì)不同碳源的利用速率和效率也不一樣，同時(shí)不同碳源發(fā)酵的同一菌體得率和產(chǎn)物收率也不同，所以選擇合適的碳源非常重要。在PDM培養(yǎng)基中用不同碳源做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其添加量為10 g·L-1，考察碳源對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 碳源對(duì)質(zhì)粒DNA產(chǎn)量和菌量的影響

由圖1可知,用乳糖和蔗糖作碳源時(shí)，菌量和質(zhì)粒DNA含量較低，用葡萄糖作碳源時(shí)，質(zhì)粒DNA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于用甘油作碳源，這是由于過(guò)多的葡萄糖會(huì)過(guò)分加速菌體的呼吸，大大降低培養(yǎng)基內(nèi)的溶氧，使得一些中間代謝物不能完全氧化而積累在菌體或培養(yǎng)基內(nèi)，如乳酸、乙酸等酸性物質(zhì)，從而嚴(yán)重地影響了質(zhì)粒的復(fù)制，而用甘油作碳源時(shí)，其在一定程度上能夠避免一些中間代謝物的阻礙作用和抑制性有機(jī)酸的積累，因此，雖然菌量不是最高，但質(zhì)粒含量和單位菌體質(zhì)粒含量卻最高，表明甘油是大腸桿菌產(chǎn)pVAXON-hCGβ質(zhì)粒的最佳碳源。

2.2 初始甘油濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響

將大腸桿菌DH5α菌株培養(yǎng)在以甘油為唯一碳源的改良PDM培養(yǎng)基中，考察初始甘油濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 初始甘油濃度對(duì)菌量和質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的影響

由表1可知，隨著初始甘油濃度的增加，菌量變化不大，但質(zhì)粒含量卻有較大差別，初始甘油濃度為2 g·L-1時(shí)，質(zhì)粒含量較高，隨著初始甘油濃度的進(jìn)一步提高，質(zhì)粒含量下降，隨后繼續(xù)上升，當(dāng)初始甘油濃度為10 g·L-1時(shí)，菌量只有2.23 g·L-1，但質(zhì)粒含量和單位菌體質(zhì)粒含量卻達(dá)到最高，分別為9.54 mg·L-1和4.29 mg·g-1。

2.3 C/N比對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響

改變PDM培養(yǎng)基中NH4Cl濃度，使碳氮比(C/N)在4.39～6.84之間變化，考察C/N比對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 C/N比對(duì)菌量和質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的影響

由圖2可知，菌量、質(zhì)粒DNA含量和單位菌體質(zhì)粒含量受C/N比影響較大，質(zhì)粒含量在C/N比為5.24時(shí)可達(dá)6.068 mg·L-1。C/N比對(duì)質(zhì)粒DNA含量影響較大的原因仍不是很清楚，但Bryers等[4]認(rèn)為大腸桿菌中質(zhì)粒的丟失率與C/N比有很大的關(guān)系，當(dāng)大腸桿菌在較高的C/N比中生長(zhǎng)時(shí)，代謝的葡萄糖大部分被用于胞外聚合物的生產(chǎn)，這有可能使細(xì)胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)受到影響，從而使質(zhì)粒的產(chǎn)量減少。

2.4 檸檬酸鈉濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響

向改良的PDM培養(yǎng)基中添加不同濃度(0～9 g·L-1)的檸檬酸鈉，考察其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 檸檬酸鈉濃度對(duì)菌量和質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的影響

由圖3可知，添加檸檬酸鈉后菌量下降，隨其濃度的不斷增加，菌體生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，當(dāng)檸檬酸鈉添加量小于3 g·L-1時(shí)，質(zhì)粒DNA含量不斷提高，添加量為3 g·L-1時(shí)質(zhì)粒DNA含量最高為11.73 mg·L-1，提高了20%。這是因?yàn)闄幟仕?、ATP是磷酸果糖激酶(PFK)的變構(gòu)抑制劑，胞內(nèi)檸檬酸可通過(guò)加強(qiáng)ATP的抑制效應(yīng)來(lái)抑制磷酸果糖激酶的活力，檸檬酸鈉的添加降低了PFK的活力，而PFK又是影響EMP途徑通量的關(guān)鍵酶，其活力降低則糖酵解過(guò)程減慢。另外，檸檬酸可以增加鈣離子的吸收，而鈣離子是丙酮酸激酶(PK)的強(qiáng)烈抑制劑，因此檸檬酸鈉的添加導(dǎo)致了糖酵解途徑中關(guān)鍵酶PFK和PK活力的降低，從而引起糖酵解過(guò)程酶反應(yīng)速率減慢，通量減少，進(jìn)而導(dǎo)致HMP途徑代謝通量的增加，為核酸的生物合成提供更多的前體。

2.5 氟化鈉濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響

在菌體生長(zhǎng)8 h后向改良的PDM培養(yǎng)基中添加不同濃度的氟化鈉，考察其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 氟化鈉濃度對(duì)菌量和質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的影響

由圖4可知，添加氟化鈉后菌量有所下降，但質(zhì)粒含量和單位菌體質(zhì)粒含量卻隨氟化鈉濃度的增大而增大，當(dāng)添加氟化鈉濃度為120 mg·L-1時(shí)，質(zhì)粒含量和單位菌體質(zhì)粒含量最高為12.09 mg·L-1和4.851 mg·g-1，質(zhì)粒含量比未添加氟化鈉時(shí)提高了29%。當(dāng)濃度超過(guò)120 mg·L-1后，質(zhì)粒含量開(kāi)始下降。這可能是因?yàn)榉c是糖酵解抑制劑，可以降低糖酵解途徑中丙酮酸激酶的酶活力[5]，從而有效地減少了糖酵解途徑的代謝流，可使更多的糖類(lèi)轉(zhuǎn)向HMP途徑，為核苷酸和核酸的生物合成提供更多的前體。

2.6 乙醇濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響

向改良的PDM培養(yǎng)基中添加不同濃度的乙醇，考察其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 乙醇濃度對(duì)菌量和質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的影響

由圖5可知，加入不同濃度的乙醇后菌量均下降，當(dāng)乙醇添加量為2 g·L-1時(shí)，質(zhì)粒含量最高為12.94 mg·L-1，比未添加時(shí)提高了32%，隨乙醇濃度的進(jìn)一步增大，質(zhì)粒DNA含量下降。一般認(rèn)為培養(yǎng)基組成對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率有影響，并進(jìn)而影響質(zhì)?？截悢?shù)。細(xì)胞分裂過(guò)快，質(zhì)粒復(fù)制速率趕不上細(xì)胞分裂速率，容易造成質(zhì)粒丟失，細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率越快，質(zhì)?？截悢?shù)越低。加入乙醇后，由于其能夠降低水活度和乙醇本身的毒性，對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致生長(zhǎng)速率的減緩，質(zhì)?？截悢?shù)提高。而高濃度的乙醇毒性增加，對(duì)維持細(xì)胞、酶與膜的功能與結(jié)構(gòu)不利，導(dǎo)致菌量和質(zhì)粒拷貝數(shù)下降。另外，Stouthamer[6]發(fā)現(xiàn)，合成1 g(34.7 mmol)不含質(zhì)粒的細(xì)胞所需的能量大部分被用于蛋白合成，只有3.2%的能量用于DNA合成，而含有質(zhì)粒的細(xì)胞中帶有卡那霉素抗性基因，由于這些細(xì)胞中卡那霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的合成致使ATP需求增加了24%[7]，因此卡那霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的合成可能是質(zhì)粒DNA復(fù)制的一個(gè)瓶頸，而乙醇在代謝過(guò)程中被氧化成乙酸，并釋放能量，產(chǎn)生ATP，因此乙醇的加入可能同時(shí)還起到了能源的作用。

3 結(jié)論

(1)甘油是質(zhì)粒DNA生產(chǎn)的最佳碳源；C/N比對(duì)質(zhì)粒DNA含量影響明顯。向改良的PDM培養(yǎng)基中添加3 g·L-1的檸檬酸鈉，可以降低糖酵解途徑的代謝通量，使質(zhì)粒含量達(dá)到11.73 mg·L-1, 提高了20%。

(2)氟化鈉是糖酵解途徑的抑制劑，在菌體生長(zhǎng)8 h后，向改良的PDM培養(yǎng)基中添加濃度為120 mg·L-1的氟化鈉，培養(yǎng)后質(zhì)粒DNA含量為12.09 mg·L-1,提高了29%。氟化鈉是具有一定毒性的物質(zhì)，在合適的時(shí)間添加適量的氟化鈉才會(huì)在基本不影響菌體正常代謝的條件下提高質(zhì)粒DNA的含量。本實(shí)驗(yàn)未深入研究氟化鈉對(duì)菌體的負(fù)面影響。

(3)在改良的PDM培養(yǎng)基中添加2 g·L-1的乙醇，可使質(zhì)粒DNA含量達(dá)到12.94 mg·L-1，比未添加時(shí)提高了32%。乙醇提高質(zhì)粒DNA含量的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究，且乙醇易燃，存在安全隱患問(wèn)題。

參考文獻(xiàn)：

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