2,4-二硝基苯肼顯色法測(cè)定環(huán)己酮含量

環(huán)己醇及其衍生物是醫(yī)藥、農(nóng)藥、有機(jī)化工領(lǐng)域的重要中間體，如：4-(4-氯代苯基)環(huán)己醇是制備阿托喹酮等多種醫(yī)藥和多種液晶材料的重要中間體[1]，反式4-乙酰氨基環(huán)己醇是合成新型祛痰藥鹽酸氨溴索登的醫(yī)藥中間體[2]。雖然取代環(huán)己醇在很多天然物質(zhì)中普遍存在，但是關(guān)于通過生物催化方法，特別是利用基因工程的方法構(gòu)建還原環(huán)己酮類衍生物的生物催化劑的報(bào)道甚少[3]。

2006年，Bali等[4]在大腸桿菌中異源表達(dá)了糖多孢紅霉菌聚酮合成酶模塊1中的酮還原酶域基因，研究表明該酶域?qū)Νh(huán)己酮類衍生物有較強(qiáng)的活性，且可通過定向進(jìn)化技術(shù)提高該酶域的還原能力。但是該研究在篩選目標(biāo)突變型菌株時(shí)，采用的是96孔板高通量篩選方法，通過監(jiān)測(cè)NADPH在340 nm處吸光度的變化，來獲得對(duì)環(huán)己酮衍生物還原能力提高的重組菌株，工作繁瑣。

目前國(guó)內(nèi)測(cè)定環(huán)己酮的方法主要有氣相色譜法[5]、糠醛顯色法[6]等。作者參考文獻(xiàn)[7]，利用2,4-二硝基苯肼顯色法測(cè)定重組菌株未還原的環(huán)己酮的含量，來初步篩選還原環(huán)己酮能力提高的突變重組菌。2,4-二硝基苯肼顯色法測(cè)定環(huán)己酮含量，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果可靠，對(duì)儀器要求也不高，可大大簡(jiǎn)化定向進(jìn)化篩選環(huán)己酮還原能力強(qiáng)的突變株的工作。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌EscherichiacoliBL21、pET-28a質(zhì)粒，安徽大學(xué)張部昌教授惠贈(zèng)；異源表達(dá)糖多孢紅霉菌聚酮合成酶模塊1酮還原酶域基因的重組大腸桿菌E.coliBL21 (pET-eryKR1)2及異源表達(dá)枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的重組大腸桿菌E.coliBL21 (pET-gdh) 1，自行構(gòu)建保藏。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[8]配制,篩選抗性菌株時(shí),加卡拉霉素至終濃度100 μg·mL-1。

1.3 試劑

環(huán)己酮(色譜純)，上海晶純化學(xué)試劑廠；2,4-二硝基苯肼(分析純)、環(huán)己醇(化學(xué)純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 方法

1.4.1 酶的誘導(dǎo)表達(dá)

E.coliBL21 (pET-eryKR1)2或E.coliBL21 (pET-gdh) 1菌株按5%的接種量接入30 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)約3 h(OD=1.0左右)，加入1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)酶，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，于4℃、4000 r·min-1離心10 min，獲得的菌體用0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.4)懸浮洗滌數(shù)次，離心，收獲菌體。

1.4.2 重組菌催化還原環(huán)己酮

取0.2 gE.coliBL21 (pET-eryKR1)2[或作為陰性對(duì)照的E.coliBL21 (pET28a)]和0.05 gE.coliBL21 (pET-gdh)1懸浮于10 mL 0.1 mol·L-1的磷酸鉀緩沖溶液(pH值7.4)中，再加入0.025 g葡萄糖及10 mmol·L-1環(huán)己酮底物。30℃、100 r·min-1振蕩反應(yīng)6 h后，于4℃、4000 r·min-1離心10 min，取上清液，測(cè)環(huán)己酮含量。

1.4.3 環(huán)己酮含量的測(cè)定方法

2,4-二硝基苯肼試劑的配制：取2,4-二硝基苯肼1 g，加入7.5 mL濃硫酸，溶解后將此溶液慢慢倒入75 mL 95%乙醇中，用水稀釋至250 mL。

取25 μL環(huán)己酮上清液加入到試管中，再加入100 μL 2，4-二硝基苯肼試劑，沉淀充分后，加入5 mL 0.8 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，混勻，測(cè)吸光度。

1.4.4 檢出限和精密度的測(cè)定

檢出限和精密度的測(cè)定參照文獻(xiàn)[6]和[9]。平均數(shù)X0、標(biāo)準(zhǔn)差s及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差CV根據(jù)文獻(xiàn)[6]計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對(duì)環(huán)己酮和2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成的苯腙衍生物以及2,4-二硝基苯肼進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果如圖1所示。

圖1 環(huán)己酮苯腙衍生物(a)和2,4-二硝基苯肼(b)的紫外分光光譜

由圖1可知，苯腙衍生物的最大吸收峰在428 nm，而2,4-二硝基苯肼在428 nm波段之后的吸收值比較小，在520 nm之后幾乎為0。因此，選擇2,4-二硝基苯肼顯色法檢測(cè)環(huán)己酮的掃描波長(zhǎng)為520 nm。

取5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL 10 mmol·L-1環(huán)己酮樣品加入到試管中，再加入100 μL 2,4-二硝基苯肼試劑，沉淀充分后，加入5 mL 0.8 mol·L-1氫氧化鈉溶液，混勻，以蒸餾水作為空白對(duì)照，在520 nm處測(cè)吸光度。以環(huán)己酮濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)、OD520值為縱坐標(biāo)，繪制環(huán)己酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。擬合線性回歸方程為：y=0.1257x+0.019，R=0.9973。

圖2 環(huán)己酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 重組菌還原環(huán)己酮的量的檢測(cè)

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的E.coliBL21 (pET-eryKR1)2菌株，以環(huán)己酮為底物按1.4.2方法進(jìn)行生物催化還原，測(cè)得還原后剩余環(huán)己酮與2，4-二硝基苯肼形成的苯腙衍生物的OD520為0.349，而陰性對(duì)照E.coliBL21 (pET28a)對(duì)應(yīng)的OD520為0.637，進(jìn)一步計(jì)算得出：經(jīng)E.coliBL21 (pET-eryKR1)2菌株催化還原后，環(huán)己酮的剩余濃度為538.19 mg·L-1(10 mL的轉(zhuǎn)化液中)，而已知環(huán)己酮初始濃度為981.4 mg·L-1(即10 mmol·L-1)，故還原環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化率為45.2%。這與利用氣相色譜法分析E.coliBL21 (pET-eryKR1)2菌株還原環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化液，根據(jù)峰面積測(cè)得的該菌株還原環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化率基本一致。由此可見，通過在520 nm處檢測(cè)環(huán)己酮和2,4-二硝基苯肼反應(yīng)的環(huán)己酮苯腙衍生物的吸光度，再根據(jù)環(huán)己酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.1257x+ 0.019，可推測(cè)體系中未被還原的環(huán)己酮的量，從而獲得轉(zhuǎn)化率。

2.3 檢出限

對(duì)520 nm處測(cè)定的7個(gè)空白值(如表1)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，得X0=-0.107，s=0.00786，檢出限L0=3s/K=3×0.00786/0.1257 =188 μg·L-1。

表1 檢出限測(cè)量數(shù)據(jù)

2.4 精密度

對(duì)一定濃度的二硝基苯腙樣品進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，在520 mn處測(cè)定5個(gè)二硝基苯腙吸光度(表2)，計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)差SD=0.0115，而相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差CV=1.52%。

表2 精密度測(cè)量數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

建立了利用環(huán)己酮和2,4-二硝基苯肼顯色反應(yīng)來檢測(cè)環(huán)己酮含量的方法，環(huán)己酮濃度在0～5 mg·L-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好，線性方程為：y=0.1257x+0.019，R=0.9973。在10 mL轉(zhuǎn)化液的實(shí)驗(yàn)條件下，方法的檢出限為188 μg·L-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為1.52%。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度較高、結(jié)果可靠，能滿足篩選突變體的要求。

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