制備環(huán)境對(duì)N-乙酰半胱氨酸木糖醇注射液有關(guān)物質(zhì)的影響

方紅英，王福根，莊讓笑，席建軍，邵益丹，繆斌，吳錫銘

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第六醫(yī)院，浙江 杭州 310014）

N-乙酰半胱氨酸木糖醇注射液（NACX）是我院研制的用于治療慢性重癥肝炎的制劑[1]。由于N-乙酰半胱氨酸（NAC）在水溶液中很不穩(wěn)定，其分子中的巰基易發(fā)生自動(dòng)氧化，產(chǎn)品在制備過(guò)程中可產(chǎn)生的雜質(zhì)有 L-半胱氨酸（CSH）、L-胱氨酸（CSSC）、N，N-二乙酰胱氨酸（ASSA）等，其中 N，N-二乙酰胱氨酸能明顯影響產(chǎn)品的質(zhì)量。第5版歐洲藥典（EP）、2003年版英國(guó)藥典（BP）對(duì)這些有關(guān)物質(zhì)的含量有著嚴(yán)格的限制。為進(jìn)一步嚴(yán)格控制NACX中的雜質(zhì)，提高制劑質(zhì)量，筆者參照BP的測(cè)試方法，對(duì)在不同制備環(huán)境中產(chǎn)生的上述有關(guān)物質(zhì)含量進(jìn)行比較試驗(yàn)，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀。NACX（自制）；N-乙酰半胱氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸對(duì)照品，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；N，N-二乙酰胱氨酸（自制）；庚烷磺酸鈉為高效液相色譜專用試劑，磷酸、磷酸二氫鈉為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ODS柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鈉1.38 g，庚烷磺酸鈉3.2 g，加水700 mL溶解后，用磷酸調(diào)pH 2.15，加水至1 000 mL）-甲醇（95 ∶5）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 溶液制備

取NACX適量，加流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度為4 mg/mL的溶液，作為供試品溶液。分別稱取N-乙酰半胱氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N，N-二乙酰胱氨酸對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每1 mL中含上述成分各1 mg的溶液，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣記錄色譜圖（圖1）。結(jié)果表明，在該色譜條件[2]下，N-乙酰半胱氨酸與3種雜質(zhì)均能達(dá)到基線分離，L-胱氨酸、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、N，N-二乙酰胱氨酸的色譜峰保留時(shí)間約為1.5，2.0，3.5，6.4 min。

線性關(guān)系考察：精密稱取N-乙酰半胱氨酸和3種雜質(zhì)對(duì)照品適量，加流動(dòng)相配制成相當(dāng)于有關(guān)物質(zhì)檢查用對(duì)照品溶液的80%，90%，100%，110%，120%濃度的5種溶液，分別進(jìn)樣20 μL，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程見表1。

精密度試驗(yàn)：取線性關(guān)系考察項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的 RSD范圍在0.1% ～0.9%，表明儀器精密度良好。

圖1 各雜質(zhì)典型的色譜分離圖

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品適量，分別加入不同量的N-乙酰半胱氨酸對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備溶液并依法測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 N-乙酰半胱氨酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2 穩(wěn)定性影響因素考察

2.2.1 pH

取NAC和木糖醇，用注射用水制成含量為99.6%的注射液，以 NaOH 或 HCI調(diào) pH 分別為 2.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，灌封于250 mL輸液瓶中，于115℃加熱30 min后，分別進(jìn)行液相色譜分析。結(jié)果見表3。可見，7種不同pH的溶液加熱前后pH、澄明度無(wú)明顯變化，而NAC含量有不同程度的改變。NAC的氧化、水解產(chǎn)物在酸性溶液中為CSH和CSSC，在堿性溶液中以ASSA為主，但在pH為6.0～7.0范圍內(nèi)溶液較穩(wěn)定，分解產(chǎn)物也相對(duì)減少。綜合上述結(jié)果和結(jié)合臨床要求，NACX溶液pH以6.5～7.5為妥。

表3 不同pH溶液加熱后各雜質(zhì)含量變化

2.2.2 氧

取樣品，按2.2.1項(xiàng)下方法制成pH約為6.5的溶液，在配制溶液及容器空間分成通氮和不通氮兩組。通氮組所用注射用水預(yù)先煮沸，通入氮?dú)?，冷?0℃；不通氮組按一般方法配制。兩組樣品分別經(jīng)日光照射3 d和115℃加熱30 min，并依法測(cè)定pH及各雜質(zhì)含量，結(jié)果見表4。

表4 通氮?dú)鈱?duì)光照和高溫滅菌條件下NAC溶液中各雜質(zhì)含量的影響

2.2.3 光照

取樣品，按2.2.2項(xiàng)下通氮組方法配制溶液，調(diào)pH約為6.5，置光照度為4 000 lx的光照箱內(nèi)，間隔一定時(shí)間取樣分析。結(jié)果見表5。

表5 光照對(duì)通氮NAC溶液各雜質(zhì)的影響

2.2.4 加熱

取樣品，按2.2.2項(xiàng)下通氮組方法配制溶液，調(diào)pH約為6.5，置 90 ℃進(jìn)行恒溫加速試驗(yàn)，間隔 0，24，48，72，96，120，144 h 取樣分析。結(jié)果見表6。

表6 通氮NAC溶液在恒溫（90℃）條件下不同時(shí)間各雜質(zhì)含量變化

2.3 室溫留樣考察試驗(yàn)

取樣品，在室溫條件下放置，并定期進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果見表7。

表7 通氮NAC溶液室溫留樣考察的雜質(zhì)含量變化

3 討論

N-乙酰半胱氨酸分子結(jié)構(gòu)中含有巰基，在水溶液中易發(fā)生自動(dòng)氧化，溶液中的溶氧和容器空間氧及溶液的pH對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響較大，溫度、光照等對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性也有一定影響。由于N-乙酰半胱氨酸的氧化還原電位很小，一般抗氧劑不僅不能發(fā)揮抗氧作用，反而會(huì)促進(jìn)其氧化，若遇高溫則氧化更迅速，故配制時(shí)必須嚴(yán)格控制溫度。

穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，本品在合適的工藝條件范圍內(nèi)能克服上述多項(xiàng)不穩(wěn)定因素，故產(chǎn)品質(zhì)量容易控制，能符合注射劑的質(zhì)量要求。另外，采用高效液相色譜法能有效控制雜質(zhì)，客觀反映產(chǎn)品質(zhì)量。

[1]吳 剛，郭樹華.N-乙酰半胱氨酸在肝病治療中應(yīng)用[J].中華肝臟病雜志，2004，12（3）：185-186.

[2]韓曉捷，黃哲蘇，李海生.反相離子對(duì)色譜法測(cè)定乙酰半胱氨酸注射液含量及有關(guān)物質(zhì)的方法研究[J].天津藥學(xué)，2005，17（6）：7-9.