高效液相色譜法測(cè)定固經(jīng)丸中黃芩苷含量

張 捷，張艷萍，王 歡，劉昌葉，譚生建

（1.中國(guó)人民解放軍第306醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100101； 2.中國(guó)人民解放軍白求恩軍醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，河北 石家莊 050000）

固經(jīng)丸由黃柏、黃芩、白芍、香附等6味藥材細(xì)粉用水泛丸制成，具有滋陰清熱、固經(jīng)止帶功能，用于治療陰虛血熱，月經(jīng)先期，經(jīng)血量多、色紫黑，赤白帶下[1]。黃芩苷為固經(jīng)丸中清熱、抗炎的活性成分。2005年版《中國(guó)藥典（一部）》中收載了固經(jīng)丸的性狀、鑒別、檢查等項(xiàng)目，但無(wú)含量測(cè)定方法；黃芩及其制劑中的黃芩苷含量測(cè)定報(bào)道有高效液相色譜（HPLC）法[1-3]。目前，固經(jīng)丸中黃芩苷的含量測(cè)定方法尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)建立了測(cè)定固經(jīng)丸中黃芩苷含量的HPLC法，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，包括2800液相色譜泵、7215型手動(dòng)進(jìn)樣器、BIO-Dimension紫外可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器（美國(guó)BIO-RAD公司）；TL-9900型色譜數(shù)據(jù)工作站（北京泰樂(lè)公司）。黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為0715-9708，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；試驗(yàn)用藥材經(jīng)本院藥檢室鑒別均符合2005年版《中國(guó)藥典（一部）》規(guī)定；試驗(yàn)用固經(jīng)丸及陰性樣品（本院制劑室制備）；乙腈（天津市西華特種試劑廠，批號(hào)為20041018）為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Intersil C18分析色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），C18保護(hù)柱（北京分析儀器廠，5 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -水（26 ∶74，含 5 mL 三乙胺，以磷酸調(diào) pH=2.6）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm；進(jìn)樣量：10 μL。在上述色譜條件下，取 2.2項(xiàng)下3種溶液，分別進(jìn)樣并記錄色譜圖（圖1）?？梢?jiàn)，黃芩苷保留時(shí)間約為13.5 min，與相鄰峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)為2 950。

2.2 溶液制備

取黃芩苷對(duì)照品20.2 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液（每1 mL含黃芩苷202.0 μg）。取固經(jīng)丸12 g，研細(xì)，取細(xì)粉0.38 g（相當(dāng)于黃芩0.05 g），精密稱定，置25 mL量瓶中，精密加70%乙醇25 mL，精密稱定，超聲處理（功率240 W，頻率45 kHz）40 min，放冷，精密稱定，補(bǔ)足減失的溶劑，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺黃芩陰性樣品0.38 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取對(duì)照品貯備液（202.0 μg/mL）1，5，10，20，25 mL，置 50 mL 量瓶中，加 70%乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別取各稀釋液注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，以峰面積 Y對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量濃度 X進(jìn)行線性回歸，回歸方程為 Y=796 121.5 X+621 926.0，r=0.999 9（n=5）。結(jié)果表明，黃芩苷質(zhì)量濃度線性范圍是 20.20 ～ 202.00 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液（101.0 μg/mL），重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果峰面積的 RSD=1.6%（n=5），表明儀器精密度良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：取樣品10 g，研細(xì)，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果黃芩苷含量的 RSD=1.7%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，于0，1，2，4，6 h時(shí)依法進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。結(jié)果峰面積的 RSD=1.3%（n=5），表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20050304-1）10 g，研細(xì)，取細(xì)粉0.19 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，精密加入對(duì)照品貯備液12.5 mL，加70%乙醇12.5 mL，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備溶液并依法測(cè)定黃芩苷的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄黃芩苷色譜峰面積，外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。結(jié)果批號(hào)為20050304-1，20050304-2，20050304-3的3批樣品中黃芩苷含量分別為1.2%，1.1%，1.2%。

3 討論

經(jīng)紫外光譜掃描發(fā)現(xiàn)，黃芩苷在276 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此選擇276 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。對(duì)2005年版《中國(guó)藥典（一部）》黃芩項(xiàng)下含量測(cè)定采用的流動(dòng)相和本試驗(yàn)中的流動(dòng)相進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示，以黃芩苷色譜峰計(jì)算，藥典方法的流動(dòng)相理論塔板數(shù)在1 900～2 000，本試驗(yàn)中流動(dòng)相的理論塔板數(shù)在2 900～3 000，表明本試驗(yàn)中的流動(dòng)相的適用性較好。參考2005年版《中國(guó)藥典（一部）》黃芩項(xiàng)下含量測(cè)定方法，以70%乙醇為溶劑，分別試驗(yàn)了超聲提取30，40，50 min的提取效果，以超聲50 min的提取率為100%計(jì)算，超聲30 min和40 min的提取率分別為99.9%和101.2%，故確定超聲提取時(shí)間為40 min。

本方法操作簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于固經(jīng)丸中黃芩苷的含量測(cè)定。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005:211.

[2]楊立新，列 岱，馮學(xué)鋒，等.高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地黃芩中黃酮化合物的含量[J]. 中國(guó)中藥雜志，2002，27（3）：166-168.

[3]楊 帆，李 攀，鄧開(kāi)英.高效液相色譜法測(cè)定小兒牛黃清肺丸中黃芩苷含量[J]. 中國(guó)藥業(yè)，2008，17（18）：32-33.