基因組步移技術擴增嗜水氣單胞菌J-1株脂酶基因全長及原核表達*

巢 偉,劉永杰,陸承平

(南京農業(yè)大學 農業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點實驗室,江蘇南京 210095)

基因組步移技術擴增嗜水氣單胞菌J-1株脂酶基因全長及原核表達*

巢 偉,劉永杰,陸承平

(南京農業(yè)大學 農業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點實驗室,江蘇南京 210095)

根據已發(fā)表的引物序列合成一對引物,以嗜水氣單胞菌J-1株基因組為模板擴增脂酶基因,得到一個保守的383 bp基因片段。進一步應用基因組步移技術擴增其兩側未知序列,分別以DraⅠ,EcoRⅤ,PvuⅡ,ScaⅠ,StuⅠ,SmaⅠ6個內切酶酶切的基因組構建6個不同的基因組步移文庫,再以基因組步移文庫為模板,設計引物向已獲得的保守片段兩側進行PCR擴增,將擴增到的兩側序列與保守片段拼接后得到一個3 476 bp的片段,通過DNA Star軟件分析,找到一個2 415 bp的開放閱讀框,經Blast軟件分析,其與嗜水氣單胞菌ATCC 7966脂酶、嗜水氣單胞菌AH-3磷脂酶A1、嗜水氣單胞菌H3脂酶、嗜水氣單胞菌Mcc-2脂酶、嗜水氣單胞菌JMP636磷脂酶C的序列同源性分別為97%、97%、88%、83%和82%。將DNA序列翻譯成氨基酸序列后,發(fā)現(xiàn)其包含一個多肽序列(VHFLGHSLGA),這個序列在脂酶中高度保守。

嗜水氣單胞菌;基因組步移;脂酶

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)是淡水魚暴發(fā)性敗血癥的主要病原[1-2],該菌能夠引致淡水魚的敗血癥和人的腹瀉等[3]。嗜水氣單胞菌能分泌一系列胞外酶,這些酶對該細菌的生態(tài)適應,生存及致病性起著十分關鍵的作用[4]。脂酶是嗜水氣單胞菌胞外酶的一種,有資料表明脂酶有可能通過與人白細胞相互作用,或通過脂肪分解產生的脂肪酸影響免疫系統(tǒng)功能從而構成毒力因子[5]。本試驗以嗜水氣單胞菌我國分離魚源株Ah J-1株為模版,應用基因組步移技術擴增脂酶基因全長,為進一步研究脂酶的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)J-1株為陳懷青等從江蘇某養(yǎng)殖場患細菌性敗血癥的病魚中分離鑒定,由南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院微生物實驗室保存。

DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0,核酸內切酶DraⅠ,EcoRⅤ,PvuⅡ,ScaⅠ,StuⅠ,SmaI,LATaq酶,T4 DNA Ligase,Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0,pMD 18-T Vector均為寶生物工程(大連)有限公司產品。蛋白純化試劑盒HisTrapTMHP為GE Healthcare公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細菌基因組提取 取1 L過夜培養(yǎng)的Ah J-1株菌液7 000 r/min離心,參照文獻[6]提取Ah J-1株基因組。

1.2.2 脂酶基因保守片段的擴增 參照文獻[7]提供的引物序列擴增嗜水氣單胞菌J-1株脂酶基因保守片段,引物序列如下:LipF:5′-ATCTTCTCCGACTGGT TCGG 3′;LipR:5′-CCGTGCCAGGACTGGGTCT T-3′。

引物合成在上海英駿生物技術有限公司完成。

PCR循環(huán)參數如下:94℃5 min;94℃25 s,55℃25 s,72℃30 s,30個循環(huán);72℃10 min。

1.2.3 基因組步移技術擴增Ah J-1株脂酶基因

1.2.3.1 接頭合成 walking adapter primer 1(W AP-1)(5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGG TGGC-3′)和互補鏈 walking adapter primer 4(W AP-4)(5′-p-GCCACCACG-NH2-3′)由寶生物工程(大連)有限公司合成,并由該公司退火形成雙鏈(即A-dapter)。

1.2.3.2 構建基因組步移文庫 采用100 UDraⅠ,EcoRⅤ,PvuⅡ,ScaⅠ,StuⅠ,SmaⅠ分別酶切10 μg Ah J-1 株基因組 DNA,酶切時間 18 h,酶切體系100 μL。酶切后的基因組DNA采用寶生物工程(大連)有限公司DNA Fragment Purification Kit Ver 2.0分別回收。然后將酶切后的基因組DNA與接頭連接,連接體系如下[8-9]:Adapter終濃度5 μ mol/L;酶切后的 Ah J-1 株基因組 DNA 0.5 μg,T4 DNA ligase 1 μL,10 × T4 buffer 2.5 μL,ddH2 O補至 25 μL,16 ℃連接過夜,然后90℃加熱10 min滅活,-20℃保存。構建好6個不同的基因組步移文庫,將它們分別命名為:DraⅠ文庫,EcoRⅤ文庫,PvuⅡ文庫,ScaⅠ文庫,StuⅠ文庫,SmaⅠ文庫。使用時,稀釋4倍,取1 μL作PCR模板。1.2.3.3 基因組步移引物

正向基因組步移的引物

(walkerprimer1)WP-1:5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′;

(walker primer2)WP-2:5′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′;

(specific primer 1)SP-1:5′-TGCCT TACT TCCTCGCCTCG-3′;

(specific inner primer 2)iSP-2:5′-GGGACAAGGCCAAGACCC-3′。

反向基因組步移的引物:

(walkerprimer1)WP-1:5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′;

(walker primer2)WP-2:5′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′;

(reverse specific primer 1)rSP-1:5′-CCGTGCCAGGACTGGGTCT T-3′;

(reverse specific inner primer 2)riSP-2:5′-ATCCAGGGTCGGGCTCT T-3′。

引物合成在上海英駿生物技術有限公司完成。

1.2.3.4 正向基因組步移 以WP-1和SP-1為引物,6個構建好的基因組步移文庫分別作為模板進行第一輪PCR擴增,循環(huán)參數為:94℃2 min;94℃25 s,72℃4 min,7個循環(huán);94℃25 s,67℃4 min,32個循環(huán);67℃10 min。擴增后PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。擴增出條帶的PCR產物稀釋10倍,取1 μL作為模板進行第二輪套式 PCR驗證。套式PCR的引物為WP-2和iSP-2,PCR循環(huán)參數為:94℃5 min;94℃25 s,55℃25 s,72℃3 min,30個循環(huán);72℃10 min。擴增后PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3.5 反向基因組步移 以WP-1和rSP-1為引物,6個構建好的基因組步移文庫分別作為模板進行第一輪PCR擴增,循環(huán)參數同正向基因組步移的第一輪擴增參數。擴增后PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳,擴增出條帶的 PCR產物稀釋10倍,取1 μL作為模板進行第二輪套式 PCR驗證。套式PCR的引物為WP-2和riSP-2,PCR循環(huán)參數為:94℃5 min;94℃25 s,55℃25 s,72℃1 min,30個循環(huán);72℃10 min。擴增后PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 測序 將基因組步移擴增出的DNA片段與T載體連接,轉化到E.coliTop10中,送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.2.5 脂酶基因表達和表達產物純化

1.2.5.1 脂酶基因原核表達載體的構建 以基因組步移獲得的序列為模版,設計一對引物擴增脂酶基因全長,引物如下:

P1:5′-GATGAATTCATGAAAAGGAAGCTAATT-3′;EcoRⅠ

P2:5′-TTACTCGAGGACTGGCTTACTGCTTGAG-3′;XhoⅠ

PCR循環(huán)參數為:94℃5 min;94℃25 s,55℃25 s,72℃3 min,30個循環(huán);72℃10 min。擴增后PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳,并切膠回收。然后,用EcoRⅠ,XhoⅠ雙酶切PCR產物,回收酶切后的PCR產物。

用質粒提取試劑盒提取質粒pET-32a(+),EcoRⅠ,XhoⅠ雙酶切pET-32a(+),酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳,并切膠回收。

用T4連接酶連接雙酶切后的PCR產物和pET-32a(+),轉化到E.coliTop10中,挑取單克隆培養(yǎng),PCR檢測陽性克隆。再提取陽性克隆的重組質粒pET-32a-Lip轉化到E.coliBL21中,PCR檢測陽性克隆,并提取陽性克隆中重組質粒送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.2.5.2 融合蛋白誘導表達 將含重組質粒pET-32a-Lip的E.coliBL21接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600值約0.5時,誘導前取出1.5 mL菌液,然后加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導表達,分別于誘導后1 h,3 h,5 h各取1.5 mL菌液。將這四個時間點取出的菌液12 000 r/min離心1 min,全菌進行SDS-PAGE檢測,同時設含pET-32a(+)空載體的E.coliBL21誘導5 h后的全菌做對照。

1.2.5.3 融合蛋白純化 將含重組質粒pET-32a-Lip的E.coliBL21接種于2 L含Amp的LB液體培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600值約0.5時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導表達4 h,4℃,8 000 r/min離心 15 min,棄去上清,沉淀用PBS重懸,400 Hz,超聲 5 s,間隔10 s,超聲 80次,在4 ℃以8 000 r/min離心分別收集沉淀和上清,沉淀用Binding buffer溶解,沉淀和上清分別取樣進行SDS-PAGE分析。

使用蛋白純化試劑盒HisT rapTMHP純化[10-11]融合蛋白,融合蛋白活性檢測參照文獻[12]中的方法略有改動,取10 μL純化融合蛋白滴在三丁酸甘油酯平板上,37℃溫箱放置過夜后觀察三丁酸甘油酯是否被分解,同時設含 pET-32a(+)空載體的E.coliBL21超聲裂解后的上清作為對照。

2 結果

2.1 脂酶基因保守片段擴增

以Ah J-1株基因組為模板,LipF和LipR為引物進行PCR,得到一個383 bp的片段(圖1)。測序后,經Blast比對,它與嗜水氣單胞菌AH-3磷脂酶A1、嗜水氣單胞菌ATCC 51108脂酶、嗜水氣單胞菌H3脂酶基因同源性分別為97%、90%、88%。

圖1 脂酶基因保守片段擴增Fig.1 PCR amplification of a conserved fragment in lipase gene

2.2 正向基因組步移

正向基因組步移的結果(圖2),以PvuⅡ、SmaⅠ這兩個文庫為模板,在第一輪和第二輪都擴增出條帶。從圖中可以看出,PvuⅡ文庫做模板時,擴增效果最好,所以取以其為模板時,第二輪擴增出的條帶進行測序。

圖2 正向基因組步移擴增結果電泳圖Fig.2 PCR amplification products in forward genome walking

2.3 反向基因組步移

反向基因組步移的結果,第一輪(圖3),第二輪擴增(圖4),以PvuⅡ文庫,SmaⅠ文庫分別做為模板時,都擴增出條帶,但前一個文庫擴增條帶較大,所以取其第二輪擴增出的條帶測序。

2.4 序列分析

正向與反向基因組步移各得到一個片段,經測序后,大小分別為2 374 bp和1 079 bp。將這兩個片段與 383 bp的保守片段拼接起來,得到一個3 476 bp(GenBank ACCESSION:EF522105)的片段,通過DNA Star軟件分析,找到一個 2 415 bp的開放閱讀框。Blast軟件分析,該開放閱讀框與嗜水氣單胞菌ATCC 7966脂酶、嗜水氣單胞菌AH-3磷脂酶A1、嗜水氣單胞菌 H3脂酶、嗜水氣單胞菌Mcc-2脂酶、嗜水氣單胞菌JMP636磷脂酶C的序列同源性分別為97%、97%、88%、83%和 82%。在起始密碼子ATG上游7個堿基處有一個公認的SD序列—AAGAGA。該開放閱讀框編碼一個804氨基酸的蛋白,預測分子質量為82.5 ku。通過對這個蛋白的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),它含有一個氨基酸序列-VHFLGHSLGA,這個序列在脂酶中高度保守,與脂酶底物結合相關[12]。第1～17位氨基酸是一個公認的脂蛋白信號肽序列,并且第17位和18位氨基酸之間是一個公認的脂蛋白信號肽酶切位點[13]。另外一個公認的信號肽酶切位點位于第48位和49位氨基酸之間[12]。

圖3 反向基因組步移擴增結果電泳圖(第1輪PCR擴增)Fig.3 PCR amplification products in reverse genome walking(first PCR products)

圖4 反向基因組步移擴增結果電泳圖(第2輪PCR擴增)Fig.4 PCR amplification products in reverse genome walking(second PCR products)

2.5 脂酶基因全長擴增

以Ah J-1株基因組為模板,P1和P2為引物進行PCR擴增出脂酶基因全長(圖5),大小與預期的2 440 bp相符。

2.6 重組質粒PCR鑒定

以E.coliBL21陽性克隆中重組質粒為模板,P1和P2為引物進行PCR擴增(圖6),擴增片段與2 440 bp的插入片段大小相符。

圖5 脂酶基因全長擴增Fig.5 PCR amplification of the complete lipase gene

圖6 重組質粒PCR鑒定Fig.6 Identification of the recombinant plasmid by PCR

2.7 重組質粒測序

重組質粒測序結果經DNA Star軟件分析表明插入序列完全正確。

2.8 融合蛋白誘導表達及純化

誘導前和誘導后1、3、5 h的全菌SDS-PAGE結果表明,誘導后3 h蛋白表達量達到最大(圖7)。融合蛋白經蛋白純化試劑盒HisT rapTMHP純化后在分子質量約82.5 ku處得到單一條帶(圖8)。經檢測,純化融合蛋白可以分解三丁酸甘油酯,而作為對照,含pET-32a(+)空載體的E.coliBL21超聲裂解后上清不能分解。

圖7 SDS-PAGE檢測誘導表達產物Fig.7 SDS-PAGE analysis of expression products

圖8 純化融合蛋白SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE analysis of the purified fusion protein

3 討論

國外有學者對嗜水氣單胞菌不同分離株脂酶基因進行克隆、表達和分析,盡管分子大小不同,但大多都能分解酯類和三?；视皖?如對硝基苯丁酸鹽和三丁酸甘油酯。并且發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌AH-3磷脂酶C具有細胞毒性,磷脂酶C缺失株比野毒株毒性減弱,說明它是一個重要的毒力因子[13]。我國的魚源代表株Ah J-1株,與國外分離株相比,可以確定其脂酶[14-15]能分解三丁酸甘油酯,但脂酶的其他理化特性是否相似,脂酶與細菌的營養(yǎng)攝取,致病機制,生態(tài)適應有何關系,尚不得而知。下一步重點將對脂酶特性和功能進行研究。

要獲取基因組上已知序列兩側的未知序列,通過探針篩選DNA文庫是實驗室常用的方法。但這一方法費時費力,而近年來出現(xiàn)的基因組步移技術簡單、可靠,是一種建立在PCR基礎上的獲取側翼序列的有效方法[16]。國外很多學者應用該技術獲得了一些重要的未知序列。如Leung K Y等[17]應用基因組步移在嗜水氣單胞菌PPD134/91上擴增出一個23 kb毒力相關片段,而國內研究較少。本研究應用基因組步移技術,成功獲得了Ah J-1株脂酶基因全序列。為減少PCR的非特異性擴增,本文基因組步移技術采用了兩個特殊的設計。首先,接頭是一個部分雙股的DNA短序列,且短鏈的3′端被氨基封閉。WP-1是與接頭互補的引物,而在酶切片段的兩端都有接頭,那么必然會有非特異性PCR擴增。但是接頭上的特殊設計避免了這一缺點,WP-1是與接頭上缺失的那部分單鏈互補的,在第一輪PCR的第一個循環(huán)時,由于短鏈的3′端被氨基封閉,阻止了DNA聚合酶的延伸,所以WP-1并沒有結合位點。然而根據已知序列設計的引物SP-1可以擴增出一條單鏈,當這條單鏈延伸到接頭位置時,就產生了WP-1的結合位點。因此,酶切片段中沒有SP-1的結合位點,PCR擴增就不能進行。其次,套式PCR驗證。當SP-1發(fā)生非特異性結合時,必然擴增出錯誤的序列,通過在接頭和已知序列上設計套式引物進行PCR擴增驗證,這樣就可以保證得到正確的結果。

[1]Suarez G,Sierra J C,Sha J,et al.Molecular characterization of a functional type VI secretion system from a clinical isolate of aeromonas hydrophila[J].Microb Pathog,2008,44(4):344-361.

[2]Canals R,Jiménez N,Vilches S,et al.Role of Gne and GalE in the virulence ofAeromonas hydrophilaserotype O34[J].Antimicrob Agents Chemother,2008,52(4):1559-1563.

[3]陸承平.致病性嗜水氣單胞菌及其所致魚病綜述[J].水產學報,1992,16(3):282-288.

[4]Pemberton J M,Kidd S P.Secreted enzymes of aeromonas[J].FEMS Microbiol letters,1997,152:1-10.

[5]Eftimiadi C,Buzzi E,Tonetti M,et al.Short-chain fatty acids produced by anaerobic bacteria alter the phy siological responses of human neutrophils to chemotactic peptides[J].J Infect,1987,14:43-53.

[6]Rishi A S,Nelson N D,Goyal A.Genome walking of large fragments:an improved method[J].J Biotechnol,2004,111:9-15.

[7]Khajanchi B K,Fadl A A,Borchardt M A,et al.Distribution of virulence factors and molecular fingerprinting of aeromonas species isolated from water and clinical samples:suggestive evidence of water-to-human transmission[J].Appl Environ Microbiol,2010,12:1-24.

[8]王春連,趙開軍,章 琦,等.利用基因組文庫加速 Xa23基因定位的染色體步移[J].中國水稻科學,2006,20(4):355-360.

[9]梁成真,張 銳,郭三堆.染色體步移技術研究進展[J].生物技術通報,2009(10):75-82.

[10]劉 馨,孫茂盛.輪狀病毒VP4基因的原核表達、蛋白純化及動物免疫試驗[J].動物醫(yī)學進展,2006,27(12):88-90.

[11]蘭立新,肖懷秋.微生物脂肪酶生物學特性及分離純化研究進展[J].生物技術通報,2009,26(5):1-5.

[12]Chuang Y C.Molecular analysis and expression of the extracellular lipase ofAeromonas hy drophilaMCC-2[J].Microbiology,1997,143:803-812.

[13]Merino S,Aguilar A.Cloning,sequencing,and role in virulence of two phospholipases(A1 and C)from mesophilic aeromonas sp.serog roup O:34[J].Infect Immun,1999,67:4008-4013.

[14]楊國宇,王艷玲.脂肪組織甘油三酯酶研究進展[J].動物醫(yī)學進展,2007,28(7):60-62.

[15]汪小鋒,王 俊,楊江科,等.微生物發(fā)酵生產脂肪酶的研究進展[J].生物技術通報,2008(4):47-53.

[16]劉 博,蘇 喬,湯敏謙,等.應用于染色體步移的PCR擴增技術的研究進展[J].遺傳,2006,28(5):587-595.

[17]Yu H B,Leung K Y.Identification and characterization of putative virulence genes and gene clusters in aeromonas hydrophila PPD134/91[J].Appl Environ Microbiol,2005,71:4469-4477.

Amplification of Complete Lipase Gene ofAeromonas hydrophilaJ-1 by Genome Walking Technique and Prokaryotic Expression

CHAO Wei,LIU Yong-jie,LU Cheng-ping

(K ey Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology of Ministry of Agriculture,Nanj ing Agriculture University,Nanjing,Jiangsu,210095,China)

A 383 bp gene fragment within the conserved region of lipase gene fromAeromonas hydrophilaJ-1 was obtained by PCR using primers reported.Subsequently,genome walking technique was applied to amplify unknown DNA sequences flanking the 383 bp conserved fragment.Genome walking libraries were constructed using six restriction enzymes(DraⅠ,EcoRⅤ,PvuⅡ,ScaⅠ,StuⅠ,SmaⅠ)and then used as templates to amplify the unknow n flanking sequences.By linking the flanking sequences with the 383 bp fragment,we got a long fragment up to 3 476 bp.Sequencing analysis revealed a 2415 bp open reading frame.Furthermore,BLAST analysis showed the 2 415 bp ORF had 97%,97%,88%,83%and 82%homologies to the DNA sequences ofA.hydrophilaATCC 7966 lipase,A.hydrophilaAH-3 phospholipase A1,A.hydrophilaH3 lipase,A.hydrophilaMcc-2 lipase,A.hydrophilaJMP636 phospholipase C,respectively.The deduced 805 amino acid sequence contained a highly conserved sequence of VHFLGHSLGA.

Aeromonas hydrophila;genome walking;lipase

S852.6

A

1007-5038(2010)09-0001-06

2010-03-07

巢 偉(1982-),男,湖南岳陽人,碩士,主要從事動物疫苗研發(fā)工作。