腦益康藥物血清對(duì) D-半乳糖致海馬神經(jīng)元凋亡的影響

朱 燕 周愛(ài)玲 胡亞娥 茅家慧 施海燕

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 南通 226001)

阿爾茨海默病(AD)是老年人中最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,嚴(yán)重危害老年人的身心健康,并給其家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。目前治療 AD的方法僅能緩解癥狀,不能改變疾病病程,尚無(wú)有效預(yù)防和治愈措施,因而研究開(kāi)發(fā)有效的藥物成為熱點(diǎn)。近年來(lái),氧化應(yīng)激和氧自由基在 AD發(fā)病中的作用已經(jīng)被許多體外實(shí)驗(yàn)和臨床研究所證實(shí)〔1〕。腦益康(naoyikang,NYK)是由制首烏、知母、巴戟天等組成的中藥復(fù)方,具有藥物多靶位作用〔2～4〕。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用血清藥理學(xué)方法制備腦益康藥物血清,采用 D-半乳糖(D-galactose,D-gal)建立AD細(xì)胞模型,觀察腦益康藥物血清對(duì) AD細(xì)胞模型的保護(hù)作用及其機(jī)制,為腦益康的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性 SD大鼠,體重(250±10)g;24 h內(nèi) SD新生鼠;均由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào):SYXK(蘇)2002-0022。

1.1.2 藥品與試劑 NYK由南通市中醫(yī)院制劑室制成顆粒劑。D-gal(上海恒信化學(xué)試劑有限公司);維生素E(VitE,南京白敬宇制藥廠);DMEM培養(yǎng)基(美國(guó) GIBCO公司);胎牛血清(杭州四季青生物制品公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT,上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司);考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所)。PCR引物由上海英駿生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.3 儀器 754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);核酸蛋白定量監(jiān)測(cè)儀(德國(guó) Biophotometer公司);PTC-100型 PCR儀(美國(guó) MJ.RESEARCH.INC.);小源凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海小源科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 NYK藥物血清的制備 雄性 SD大鼠 15只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、VitE處理組和 NYK處理組,每組 5只。所有動(dòng)物自由飲水,適度光照。正常對(duì)照組:喂養(yǎng)基本飼料觀察 3 d后,用生理鹽水 10.0 ml/kg灌胃。VitE處理組:將 VitE溶于菜油中,配成 0.125%的溶液,按10.0 ml/kg灌胃。NYK處理組:將中藥顆粒加 ddH2O,配成 17.1%的水溶液,按 10.0 ml/kg灌胃(相當(dāng)于臨床成人用量)。各組大鼠每天灌胃 2次,連續(xù)3 d〔5〕,末次灌藥后 1 h頸總動(dòng)脈取血,4℃過(guò)夜,待全血凝固后,2 500 r/min離心 20 min,分離血清,經(jīng) 56℃,30 min滅活,0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng) 取新生 24 h的 SD大鼠,無(wú)菌條件下取腦,分離雙側(cè)海馬,剔除血管,用冰浴 D-Hank′s液洗 2次,剪碎,0.125%胰蛋白酶 2 ml,37℃消化 30 min,每 5 min振蕩 1次。用等體積含 10%胎牛血清的 DMEM終止消化,吹打成細(xì)胞懸液,1 000r/min離心 10 min,棄上清,吹打分散細(xì)胞,分別經(jīng) 60目和 200目的篩網(wǎng)過(guò)濾。計(jì)數(shù)后將細(xì)胞懸液稀釋至所需密度接種于用 0.1 mg/ml多聚賴(lài)氨酸處理的培養(yǎng)板。48 h后加入終濃度為 10μmol/L阿糖胞苷作用 24 h更換新培養(yǎng)液,以后每 2天半量換液,培養(yǎng) 6 d的海馬神經(jīng)元用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 分組與處理 將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模型組、VitE處理組、NYK處理組。正常對(duì)照組:培養(yǎng) 6 d的海馬神經(jīng)元,棄培養(yǎng)液,加入無(wú)血清 DMEM和 10%正常大鼠血清培養(yǎng) 24 h。模型組:培養(yǎng) 6d的海馬神經(jīng)元,棄培養(yǎng)液,加入無(wú)血清 DMEM、10%正常大鼠血清和 D-gal(D-gal終濃度為 100 mmol/L〔6〕)培養(yǎng) 24 h。VitE處理組:培養(yǎng) 6 d的海馬神經(jīng)元,加入無(wú)血清DMEM和 10%VitE藥物血清后 1 h,再加入 D-gal培養(yǎng) 24 h。NYK處理組:培養(yǎng) 6 d的海馬神經(jīng)元,棄培養(yǎng)液,加入無(wú)血清DMEM和 NYK藥物血清后 1 h,再加入 D-gal,其中藥物血清分別以 5.0%、10.0%、20.0%稀釋濃度添加〔7〕,培養(yǎng) 24 h。

1.2.4 MTT法檢測(cè)NYK藥物血清對(duì)D-gal誘導(dǎo)損傷后海馬神經(jīng)元存活率的影響 常規(guī)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元用含有 10%胎牛血清的 DMEM稀釋成 5×105個(gè)/ml,每孔 100μl接種于 96孔培養(yǎng)板中,使各孔細(xì)胞數(shù)基本相同;培養(yǎng)板的第 1列不接種細(xì)胞而每孔只加無(wú)細(xì)胞 DMEM,作為空白調(diào)零孔。培養(yǎng)6 d后,棄培養(yǎng)液,設(shè)正常對(duì)照組、模型組、VitE處理組、NYK處理組,每組11個(gè)復(fù)孔。每孔加入 25μl MTT溶液(終濃度 1 mg/ml),孵育4 h,每孔再加入 100μl 20%SDS,繼續(xù)孵育 24 h后取出,用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在 570 nm處的光吸收值并計(jì)算出細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率 =實(shí)驗(yàn)組 OD/對(duì)照組 OD×100%。

1.2.5 生化指標(biāo)的檢測(cè) 常規(guī)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元用含有10%胎牛血清的 DMEM稀釋成 5×105個(gè)/ml,每孔 1ml接種于24孔培養(yǎng)板中,使各孔細(xì)胞數(shù)基本相同;培養(yǎng)6 d,各組細(xì)胞按不同的要求處理,用于檢測(cè)生化指標(biāo)。收集細(xì)胞上清液檢測(cè)MDA含量、SOD和 GSH-Px活力。細(xì)胞培養(yǎng)液直接加樣檢測(cè)。具體方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.6 檢測(cè)海馬神經(jīng)元 Bcl-2 mRNA的表達(dá) 常規(guī)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元用含有 10%胎牛血清的 DMEM稀釋成 1×106/ml,每孔 2 ml接種于 6孔培養(yǎng)板中,使各孔細(xì)胞數(shù)基本相同。培養(yǎng)6 d后各組按不同的要求處理,用于 RT-PCR檢測(cè)。β-action:引物序列為上 游 5′-gcaccacactttctacaatga-3′,下游 5′-gaaccgctcattgccgatagt-3′,508bp;Bcl-2:引物序列為上游 5′-cgactttgcagagatgtcca-3′,下游 5′-catccacagagcgatgttgt-3′,202 bp。 按照 常規(guī)步 驟提取各組細(xì)胞的 RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。按設(shè)定的程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件:Bcl-2:94℃ 3 min,94℃ 40 s,48℃ 30 s,72℃ 45 s(循環(huán) 35次),72℃ 10min。 β-action為內(nèi)參。瓊脂糖凝膠電泳鑒定 PCR產(chǎn)物,用 Scion Image圖像分析軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析,以目的基因帶密度與內(nèi)參 β-action帶密度的比值表示該基因 mRNA相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均以 x±s表示,用 SAS7.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,進(jìn)行方差分析和兩兩比較,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 NYK藥物血清對(duì) D-gal誘導(dǎo)損傷后海馬神經(jīng)元存活率的影響 MTT法測(cè)定顯示,各組海馬神經(jīng)元存活率均比正常對(duì)照組(細(xì)胞存活率設(shè)為 100%)低,模型組細(xì)胞存活率(0.367±0.104)顯著降低(P＜0.01)。與模型組相比,VitE處理組(0.882±0.749)、5%NYK處理組(0.826±0.129)、10%NYK處理組(0.794±0.257)、20%NYK處理組(0.736±0.166)存活率升高(P＜0.01)。

2.2 NYK藥物血清對(duì)D-gal誘導(dǎo)損傷后海馬神經(jīng)元 MDA含量、SOD、GSH-Px活力的影響 模型組 MDA含量顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。5%、10%NYK處理組 MDA含量顯著低于模型組(P＜0.01)。模型組 SOD及 GSH-Px活力顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.01)。VitE處理組和 NYK處理組 SOD及GSH-Px活力顯著高于模型組(P＜0.01)。見(jiàn)表 1。

2.3 NYK藥物血清對(duì) D-gal誘導(dǎo)損傷后海馬神經(jīng)元 Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 模型組(0.76±0.16)海馬神經(jīng)元 Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平與正常對(duì)照組(1.24±0.39)比較,有降低趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。VitE處理組、5%NYK處理組、20%NYK處理組海馬神經(jīng)元 Bcl-2 mRNA表達(dá)分別為1.17±0.27、1.33±0.34、1.07±0.10。 10%NYK處理組海馬神經(jīng)元 Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平(1.48±0.62)高于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)圖 1。

表1 各組海馬神經(jīng)元的 MDA含量和SOD、GSH-Px活力的比較(x±s,n=6)

圖1 各組海馬神經(jīng)元 Bcl-2mRNA的表達(dá)

3 討 論

腦和神經(jīng)是耗氧率較高的器官,因?yàn)楹写罅康闹|(zhì),容易因自由基引起氧化應(yīng)激而變得脆弱。在對(duì)神經(jīng)內(nèi)科疾病進(jìn)行分類(lèi)時(shí)發(fā)現(xiàn),以腦卒中、AD、肌萎縮性側(cè)索硬化癥及 Parkinson病等與氧化應(yīng)激的關(guān)系最為密切〔8〕。AD患者腦組織和全身各系統(tǒng)都存在氧化應(yīng)激,氧化應(yīng)激是 AD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵因素,在 AD早期 NFT和 SP出現(xiàn)之前就發(fā)揮作用〔1〕,最終可造成神經(jīng)元損傷。因此,近年來(lái)自由基所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)在AD中的作用受到人們的高度重視,而且自由基損傷在散發(fā)性 AD的病因?qū)W意義更是AD研究中最活躍的領(lǐng)域之一。許多研究表明老年人和 AD患者腦內(nèi)抗氧化物質(zhì)減少,自由基增多。當(dāng)體內(nèi) D-gal過(guò)多時(shí),可產(chǎn)生過(guò)多的氧自由基,造成氧化應(yīng)激損傷〔9〕。故本研究采用 D-gal誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷,制備AD細(xì)胞模型,觀察NYK藥物血清通過(guò)抗氧化作用保護(hù)細(xì)胞,減少細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

MTT可以間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。GSH-Px是一種重要的催化H2O2分解的酶,SOD則主要清除超氧化物如。它們的活力降低,可造成腦內(nèi)大量自由基的堆積,使許多生物大分子發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)而交聯(lián)、斷裂,引起一系列異常的生化過(guò)程,以致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能破壞等。MDA是不飽和脂肪酸降解的產(chǎn)物,MDA的含量?？勺鳛榉从持|(zhì)過(guò)氧化程度及間接反映氧自由基對(duì)細(xì)胞損傷程度。此外Bc1-2基因家族中 Bcl-2是抑凋亡基因,同時(shí)也具有抗氧化劑作用,可以抑制超氧化物的產(chǎn)生;還可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)表達(dá),保護(hù)其活性,清除產(chǎn)生的自由基,起到抗凋亡作用〔10〕。本實(shí)驗(yàn)提示 NYK有一定的神經(jīng)保護(hù)作用,適宜的劑量(5%和 10%)對(duì) D-gal致海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用較好。其機(jī)制可能是通過(guò)提高神經(jīng)元的抗氧化能力,降低海馬神經(jīng)元的 MDA含量,減輕自由基損傷,上調(diào)海馬神經(jīng)元 Bcl-2 mRNA的表達(dá),從而發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用,減少細(xì)胞凋亡。

1 Ved C,Abha C.Oxidativestress in Alzheimer′s disease〔J〕.Pathophysiology,2006;13(3):195-208.

2 耿勁松,周愛(ài)玲,茅家慧,等 .腦益康對(duì) AD大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬NGF-TrkA mRNA表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2009;29(2):152-5.

3 朱 燕,周愛(ài)玲,茅家慧,等 .腦益康對(duì) D-半乳糖和亞硝酸鈉所致Alzheimer病小鼠模型的保護(hù)作用〔J〕.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2008;24(3):296-300.

4 胡亞娥,周愛(ài)玲,朱 燕,等.腦益康藥物血清對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2007;23(3):300-3.

5 王 睿 .中藥血清藥理學(xué)研究進(jìn)展〔J〕.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006;27(18):2243-4.

6 朱 燕,周愛(ài)玲,胡亞娥,等.腦益康含藥血清對(duì) D-半乳糖誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用〔J〕.南通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006;26(1):3-5.

7 胡亞娥,周愛(ài)玲.中藥復(fù)方對(duì)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)影響的時(shí)效和量效關(guān)系研究〔J〕.南通醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004;24(4):363-4.

8 阿部康三.氧化應(yīng)激與神經(jīng)系統(tǒng)疾病〔J〕.日本醫(yī)學(xué)介紹,2006;27(12):556-8.

9 Wang J,Xiong S,Xie C,et al.Increased oxidative damage in nuclear and mitochondrial DNA in Alzheimer′s disease〔J〕.J Neurochem,2005;93(4):953-62.

10 Ephrem E,Talin G,Rainer S,et al.Expression of apoptosis related proteins in brains of patients with Alzheimer′s disease〔J〕.Neurosci Lett,2001;303(2):79-82.