腦梗死患者過(guò)氧化物酶體增生激活型受體 γmRNA表達(dá)變化及其與C-反應(yīng)蛋白的相關(guān)性

盧 冬 陸小嬋 覃志堅(jiān) 韋世革

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣西 百色 533000)

過(guò)氧化物酶體增生激活型受體 γ(PPARγ)可在體內(nèi)多種組織中表達(dá),參與體內(nèi)多種生理和病理生理過(guò)程。體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明,PPARγ的激活可以抑制周圍血淋巴細(xì)胞對(duì)炎性血細(xì)胞因子的分泌。研究發(fā)現(xiàn) PPARγ的特異性配體可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)而減輕實(shí)驗(yàn)性心肌缺血組織的病理?yè)p傷〔1〕。本研究旨在觀察腦梗死患者周圍血淋巴細(xì)胞中 PPARγmRNA的表達(dá)變化及其與血清 C反應(yīng)蛋白(CRP)水平的相關(guān)性,探討PPARγ在腦缺血炎性病理?yè)p傷中的可能作用機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2005年 1月至 2008年 7月在我院神經(jīng)內(nèi)科就診的發(fā)病 3 d以內(nèi)的腦梗死患者。所有患者均符合 1995年全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔2〕。并且經(jīng) CT證實(shí),共收集符合入選條件患者 64例,排除有心肌梗死、周圍血管栓塞疾病、腫瘤患者,以及發(fā)病前 2 w有炎性病變史或入院時(shí)發(fā)生感染性疾病者(如嚴(yán)重的上呼吸道感染、肺炎、高熱等)、有嚴(yán)重的肝腎功能不全患者等。正常對(duì)照組來(lái)自同期健康體檢者,除具備以上排除標(biāo)準(zhǔn)外還均需詢問(wèn)并證實(shí)無(wú)心腦血管病史,共 60例。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取 抽清晨空腹肘靜脈肝素抗凝血 6 ml,淋巴細(xì)胞分離液提取單個(gè)核細(xì)胞后,采用吸附柱過(guò)濾法分離淋巴細(xì)胞,經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)液洗滌后加 1 ml Trizol,震勻,室溫靜置 8 min,后經(jīng)氯仿分層,異丙醇沉淀和 75%的焦碳酸二乙酯(DEPC)酒精洗滌干燥后,將所得 RNA溶液溶于 0.1%DEPC水溶液中,4℃ 12 000r/min離心 15min,吸取上清液到新的 1.5 ml菌種保存管(EP管)中,加等體積異丙醇,4℃12 000 r/min離心 10 min,棄上清,加 DEPC及新配制的 75%乙醇1 ml洗滌總 RNA,4℃ 7 500r/min離心 5min,棄去上清液,瞬時(shí)離心后用小吸管吸盡殘留液體,置冰浴盒內(nèi),自然晾干。

1.2.2 cDNA的合成 取 RNA 2μg,加 Olig(dT)18μl,于 60℃水浴 10 min,再放冰上驟冷,而后加 RNA酶抑制劑、M-MulL V逆轉(zhuǎn)錄酶等,60℃孵育 60 min,95℃滅活酶 5 min,最后將將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于 PCR擴(kuò)增。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 取上述合成的 cDNA 2μl加入 2.5 U的Taq DNA多聚酶、10×PCR緩沖液、10 mmol dNTP混合物、25 mmol MgCl2及目的引物和內(nèi)對(duì)照,PPARγ的引物序列為 5′-CTTCACTGATACACTGTCTGC-3′,長(zhǎng) 度 為 207 bp,內(nèi) 參 物 為(GAPD),長(zhǎng)度為 306bp。引物均由上海生物工程服務(wù)有限公司合成。于 PCR儀內(nèi)擴(kuò)增 31個(gè)循環(huán),反應(yīng)終末 72℃延伸10 min,最后 PCR產(chǎn)物于含有溴化乙錠(EB)的 1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.2.4 血清CRP測(cè)定 抽空腹靜脈血 2 ml(與提 RNA的血液同時(shí)抽取),離心取血清,7060全自動(dòng)生化分析儀用免疫透射比濁法測(cè)定 CRP含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)輸入 SPSS10.0數(shù)據(jù)包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,構(gòu)成比 χ2檢驗(yàn),獨(dú)立樣本間的比較采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般情況資料對(duì)比 腦梗死組除了收縮壓和白細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯升高外(P＜0.01),其余兩組在年齡、吸煙、體重指數(shù)各項(xiàng)指標(biāo)兩組間無(wú)顯著意義(P＞0.05)。見表 1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組 PPARγmRNA、血清CRP水平比較 將 PCR電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)測(cè)量,計(jì)算PPARγmRNA的相對(duì)比值。腦梗死組 PPARγmRNA表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.01),腦梗死組 CRP水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。見表 2。

表2 兩組 PPARγmRNA及 CRP表達(dá)比較(x±s)

2.3 腦梗死患者PPARγmRNA和血清CRP的相關(guān)性分析將周圍血淋巴細(xì)胞 PPARγmRNA表達(dá)和血清 CRP水平進(jìn)行相關(guān)性分析,PPARγmRNA表達(dá)越低,CRP水平越高,二者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.539,P＜0.01)。

3 討 論

PPARγ作為一種細(xì)胞核受體,通過(guò)位于靶基因啟動(dòng)子中的過(guò)氧化小體增殖物反應(yīng)元件(PPRE)結(jié)合后調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。CRP作為循環(huán)中的急性反應(yīng)時(shí)相炎癥蛋白,在各種急性炎癥、組織損傷、心肌梗死、手術(shù)創(chuàng)傷等疾病發(fā)作后數(shù)小時(shí)迅速升高,并有成倍增長(zhǎng)之勢(shì)。病變好轉(zhuǎn)時(shí),又迅速降至正常,其升高幅度與感染的程度呈正相關(guān)。在患者疾病發(fā)作時(shí),CRP可早于WBC而上升,恢復(fù)正常也很快,故具有極高的敏感性。

本研究發(fā)現(xiàn),腦梗死患者發(fā)病早期 PPARγmRNA表達(dá)明顯下調(diào),同時(shí) WBC及 CRP較較正常對(duì)照組顯著增高,且PPARγmRNA表達(dá)與CRP含量呈負(fù)相關(guān)。提示PPARγ可能參與了腦缺血的病理過(guò)程,通過(guò)調(diào)節(jié) CRP路徑參與腦梗死病理方面的炎癥反應(yīng),引起的組織損傷和促進(jìn)血栓形成。

PPARγ激活后可經(jīng)抑制包括淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞在內(nèi)的炎癥細(xì)胞的免疫活性,其特異性配體通過(guò)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)而減輕缺血性病理?yè)p傷。Atushi〔1〕研究發(fā)現(xiàn),PPARγ的特異性激活配體(BRL-49653)能夠減輕腸缺血損傷外,Wayman〔3〕等通過(guò)心肌缺血再灌注模型實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了 PPARγ激活劑能夠減輕心肌梗死面積,降低心肌病理?yè)p傷,有利于心肌功能的恢復(fù)。目前認(rèn)為,PPARγ所具有的抗缺血性損傷作用主要和其激活后抑制了炎性細(xì)胞分泌細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1),腫瘤壞死因子(TNF-α),白細(xì)胞介素(IL-8),內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子(CD18),肝組織細(xì)胞黏附因子-1(MCP-1),基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2)等細(xì)胞因子降低其活性有關(guān)。有腦缺血時(shí),淋巴細(xì)胞和單巨噬細(xì)胞均存在免疫激活現(xiàn)象,并且上述炎性相關(guān)因子表達(dá)增加后導(dǎo)致腦缺血炎性損傷。

大規(guī)模前瞻性的臨床試驗(yàn)顯示CRP的水平增高是不穩(wěn)定性動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)生的危險(xiǎn)信號(hào),也預(yù)示著缺血性腦梗死患者的預(yù)后不良。越來(lái)越多的證據(jù)表明血清CRP濃度升高與腦梗死的關(guān)系,認(rèn)為其與高血壓、糖尿病一樣,是腦梗死預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔4,5〕。研究顯示 CRP水平與急性腦梗死的發(fā)生、嚴(yán)重程度及預(yù)后呈正相關(guān)〔6〕。腦梗死病例中 CRP有顯著升高的病例傾向于大面積的梗死及更高的致殘率,而 CRP不高的病例則傾向于小面積的梗死〔7〕。本研究 64例患者 CRP濃度比正常對(duì)照組顯著增高,表明在腦梗死早期,急性時(shí)相反應(yīng)炎癥蛋白 CRP是一項(xiàng)比較敏感的檢驗(yàn)指標(biāo),有著很好的陰性預(yù)測(cè)意義。

綜上,推測(cè)腦缺血時(shí) PPARγ表達(dá)下調(diào)可能參與了腦缺血炎性病理?yè)p傷,PPARγ表達(dá)下調(diào)是腦缺血后炎性反應(yīng)的原因,并且其下調(diào)的幅度與 CRP呈負(fù)相關(guān)。既然在腦梗死中存在PPARγ表達(dá)變化,并且有可能導(dǎo)致腦缺血的炎性損傷,所以從理論上認(rèn)為對(duì)腦梗死患者給予外源性的PPARγ激活配體可減輕腦缺血的炎性損傷。

1 Atushi N,Koichiro W,Hiroshi M,et al.Endogenous PPARgamma mediates anti-inflammatory activity in murine ischemia-reperfusion injury〔J〕.Gastroenterology,2001;120(2):460-9.

2 全國(guó)第 4次腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議.腦卒中患者臨床神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(1995)〔J〕.中華神經(jīng)科雜志,1996;29(6):381-3.

3 Wayman NS,Hattori Y,Mc Donald,et al.Ligands of the peroxisome proliferator-activated receptors(PPAR-gamma and PPAR-alpha)reduce my-ocardial infarct size〔J〕.FASEB J,2002;16(9):1027-40.

4 Rost NS,Wolf PA,Kase CS,et al.Plasma concentration of C-reactive protein and risk of ischemic stroke and transient ischemic attack the Framingham Study〔J〕.Stroke,2001;32(11):2575-9.

5 Price CJS,Warburton EA,Menon DK.Human cellular inflammation in the pathology of acute cerebral ischaemia〔J〕.JNeurol Neurosurg Psychiatry,2003;74:1476-84.

6 彭 軍,章軍建.急性腦梗死患者 C-反應(yīng)蛋白水平變化〔J〕.卒中與神經(jīng)疾病,2006;13(1):45-7.

7 張微微,周小英,黃勇華.不同類型腦梗死患者血清 C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)及臨床意義〔J〕.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2004;27(11):781-3.