氨茶堿對哮喘呼吸道重塑大鼠支氣管組織中 Bcl-2及 Bax蛋白含量的影響

段旭東 趙 輝 王曉紅 于文濤 王曉媛 張雅蘭

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院中醫(yī)外科,河北 石家莊 050000)

支氣管哮喘氣管重塑是其主要臨床特征之一,是導(dǎo)致呼吸道高反應(yīng)性及肺功能持續(xù)性、進(jìn)行性損傷的主要原因,并可能導(dǎo)致頑固性哮喘〔1〕。氨茶堿作為治療支氣管哮喘的經(jīng)典藥物臨床應(yīng)用廣泛,其藥理研究多集中于抗炎、免疫調(diào)節(jié)的作用,對氣道重塑的影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過探討氨茶堿對支氣管哮喘大鼠支氣管組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax含量的影響,進(jìn)一步探討氨茶堿對支氣管哮喘氣管重塑的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級 SD大鼠 24只,雌雄各半,體重 180～220g,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供,動(dòng)物合格證號:SCXK(鄂)2004-007。室溫 20℃飼養(yǎng),自由進(jìn)食水。

1.2 藥物 氨茶堿,天津金耀氨基酸有限公司產(chǎn)品,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字 H12020978。批號:20050917,250mg,10 ml/支。

1.3 主要儀器及試劑 彩云 JWC-201D超聲霧化器:鞍山市同信醫(yī)用儀器廠產(chǎn)品。卵蛋白:美國 Sigma公司產(chǎn)品。氫氧化鋁:天津市化學(xué)試劑三廠生產(chǎn),分析純。NDY-1000彩色病理圖像分析儀:武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像科技公司生產(chǎn)。BH-2光學(xué)顯微鏡:Olympus公司生產(chǎn)。

1.4 動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)表分為正常組、模型組、氨茶堿治療組(簡稱治療組),每組 8只。治療組從第 1次哮喘激發(fā)開始灌胃給藥,直至處死,2 ml每日 1次,用藥劑量按有關(guān)公式〔2〕,將人臨床用藥劑量折算為大鼠用藥劑量,模型組、正常組均以 2 ml生理鹽水代替氨茶堿,每日 1次灌胃。

1.5 模型建立 實(shí)驗(yàn)組參照〔3〕,分別于第 1天及第 8天大鼠腹腔內(nèi)注射新鮮配制的卵蛋白溶液 1 ml(內(nèi)含卵蛋白 100 mg,氫氧化鋁 100 mg)致敏,第 15天起哮喘模型組、治療組開始霧化吸入 1%卵蛋白激發(fā)哮喘,霧化流量 5 ml/min,隔日 1次,每次 20 min,共 4 w,以大鼠出現(xiàn)呼吸加快,口唇發(fā)紺,腹肌痙攣,點(diǎn)頭呼吸及站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為激發(fā)成功。正常組以生理鹽水代替卵蛋白進(jìn)行腹腔注射及霧化吸入。

1.6 檢測指標(biāo)及方法

1.6.1 病理組織學(xué)觀察 10%水合氯醛 3.5 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉,麻醉完全后開胸,迅速結(jié)扎右主支氣管,取右肺中葉,4℃4%多聚甲醛固定,脫水、包埋、切片。HE染色,鏡下觀察病理學(xué)改變。采用 NDY 1000型圖像分析儀測量大鼠氣道壁面積、支氣管平滑肌的面積,用完整支氣管管腔的內(nèi)周長(Pi)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.6.2 支氣管上皮及其周圍組織中 Bcl-2、Bax含量測定 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度酒精脫水,磷酸緩沖液(PBS)漂洗5 min×2次;3%的雙氧水甲醇溶液室溫孵育 5～10 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,PBS洗滌 3次;將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0),微波爐加熱至沸騰后斷電,間隔 5～10 min,反復(fù) 1～2次,冷卻后 PBS洗滌 2次,滴加5%正常山羊血清封閉,室溫孵育 20 min。傾去多余液體,滴加Bcl-2和 BaxⅠ抗(1∶100稀釋)濕盒孵育,4℃冰箱內(nèi)過夜,PBS洗滌5 min×2次;滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液,37℃孵育45 min,PBS洗滌 5 min×2次;滴加試劑過氧化物酶(SABC)(1∶100稀釋),37℃孵育 20 min,PBS洗滌 5 min×2次;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色 5～15 min,終止呈色反應(yīng);蘇木素襯染,常規(guī)裱片、干燥、脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下,Bcl-2和 Bax蛋白染色呈棕黃色顆粒。Bcl-2蛋白測定:每張切片高倍鏡下(×400)由同一觀察者選取支氣管上皮四周及左上共 5個(gè)視野,計(jì)算機(jī)圖像處理軟件半定量測定支氣管Bcl-2含量(以染色吸光度值表示)。Bax蛋白測定:每張切片高倍鏡下(×400)由同一觀察者選取支氣管壁四周及左上共 5個(gè)視野,計(jì)算機(jī)圖像處理軟件半定量測定支氣管 Bcl-2含量(以染色吸光度值表示)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用 x±s表示,用 Stata8.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 支氣管面積、支氣管平滑肌面積的變化 與正常組相比,哮喘激發(fā) 4 w后模型組大鼠支氣管壁面積、平滑肌面積明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.13,P=0.00,t=2.85,P=0.00)),治療組大鼠支氣管壁面積、平滑肌面積明顯低于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.77,P=0.00,t=1.26,P=0.01)。 見表 1,圖 1。

2.2 Bcl-2、Bax蛋白含量的變化 與正常組相比,哮喘激發(fā)4 w后,模型組大鼠支氣管-肺組織中 Bcl-2、Bax蛋白含量明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=52.4,P=0.00,t=61.0,P=0.00)。與模型組相比,治療組大鼠支氣管上皮中凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2含量明顯高于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=28,P=0.009),支氣管周圍組織中Bax含量高于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=36.5,P=0.01)。見表 2,圖 2。

表1 各組大鼠氣道形態(tài)學(xué)的比較 (x±s,n=8,%)

表2 氣道重塑大鼠肺組織中 Bcl-2、Bax含量的變化(x±s)

圖1 支氣管平滑肌病理圖片(HE,×400)

圖2 Bcl-2、Bax免疫表達(dá)(DAB,×400)

3 討 論

哮喘氣管重塑本質(zhì)上是機(jī)體對氣管上皮慢性損害不完全修復(fù)的結(jié)果,Lee〔4〕等研究表明,上皮細(xì)胞損傷可誘發(fā)單核細(xì)胞浸潤、上皮下組織纖維化,成纖維細(xì)胞和肌細(xì)胞的增殖等一系列致纖維化的反應(yīng)。此過程涉及嗜酸性粒細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種因素參與,變態(tài)反應(yīng)性炎癥所導(dǎo)致的微環(huán)境改變可以導(dǎo)致氣管多種細(xì)胞 DNA合成增加以及細(xì)胞增生,從而導(dǎo)致氣管重塑,減少支氣管上皮細(xì)胞損傷,減少支氣管內(nèi)及周圍炎癥細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的數(shù)量可有效地抑制氣道重塑〔5〕。近年的研究表明細(xì)胞的凋亡受多種基因的調(diào)控,其中Bcl-2,Bax被認(rèn)為是抑制及促進(jìn)細(xì)胞凋亡最重要的調(diào)控基因。

本研究結(jié)果提示哮喘氣道重塑過程中由于氣道炎癥導(dǎo)致氣道上皮損傷,機(jī)體通過提高支氣管上皮中 Bcl-2含量從而抑制上皮細(xì)胞凋亡以對抗氣道重塑;治療組氣道上皮細(xì)胞具有更好的抗凋亡能力,氣道上皮的完整可防止由氣道上皮損傷引起的氣道重塑〔4〕。

Bax基因位于 19q13.3-13.4,由 6個(gè)外顯子組成,是重要的促凋亡基因,當(dāng)Bax大量表達(dá)時(shí),細(xì)胞對凋亡信號的反應(yīng)增強(qiáng),細(xì)胞凋亡增多,因此 Bax被稱為“死亡激動(dòng)劑”。

本實(shí)驗(yàn)提示正常情況下氣道壁-肺組織細(xì)胞凋亡數(shù)量少,提示機(jī)體在氣道重塑過程中通過加速氣道壁-肺組織細(xì)胞(包括氣道上皮基底膜細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及氣道周圍組織細(xì)胞)凋亡以抑制氣道重塑。與模型組相比,治療組支氣管壁面積、支氣管平滑肌面積均明顯降低而 Bax含量升高明顯,提示治療組較高的支氣管壁-肺組織細(xì)胞凋亡可抑制氣道重塑。

應(yīng)用氨茶堿治療哮喘已有 80多年的歷史,口服或直腸給藥吸收迅速,有效血藥濃度為 10～20 mg/L,理論上給予0.5 mg/kg氨茶堿可使血清藥物濃度上升 1 mg/L,其治療劑量與中毒劑量十分接近,20mg/L血藥濃度即可出現(xiàn)中毒反應(yīng),血清藥物濃度大于 35 mg/l時(shí)可引起呼吸急促、驚厥甚至死亡〔6〕。本實(shí)驗(yàn)中原設(shè)置的高劑量氨茶堿(70 mg/kg)組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,用藥后呼吸興奮、驚厥等中毒反應(yīng)明顯,并有數(shù)只在實(shí)驗(yàn)過程中死亡,無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

綜上所述,氨茶堿具有較好的抑制支氣管哮喘氣道重塑的作用,其作用提高支氣管上皮及支氣管壁-肺組織中 Bcl-2、Bax含量,減少氣道上皮細(xì)胞的損傷,促進(jìn)支氣管壁-肺組織細(xì)胞凋亡的作用相關(guān)。

1 彭淑梅,趙建平,王淑珍,等 .內(nèi)皮素在兒童重度哮喘中的意義及作用〔J〕.廣東醫(yī)學(xué),2002;23(2):175-6.

2 陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,1993:33.

3 王文建,王 莉,楊西華,等 .川芎嗪對大鼠支氣管哮喘模型氣道重塑的影響及機(jī)制〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志,2004;27(12):833-6.

4 Lee CG,Cho SJ,Kang MG,et al.Early growth response gene 1-mediated apoptosis is essential for transforming growth factor beta l induced pulmonary fibrosis〔J〕.J Exp Med,2004;200(3):377-89.

5 孔祥永,欒 斌,郭 杰,等 .實(shí)驗(yàn)性哮喘氣道細(xì)胞DNA合成和氣道重塑研究〔J〕.中國兒童保健雜志,2003;11(1):39-41.

6 國家藥典委員會(huì);臨床用藥須知.中華人民共和國藥典〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:244.