肌動蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶在腺樣囊性癌中表達的免疫電鏡研究

張 凡 常永霞 劉春秀 李瑞平

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院病理科,河北 張家口 075000)

腺樣囊性癌(ACC)是一種常見的涎腺惡性腫瘤,極易沿神經(jīng)生長并侵襲神經(jīng),其嗜神經(jīng)侵襲性及其跳躍性生長使 ACC的徹底治療極為困難,因此研究 ACC的嗜神經(jīng)侵襲性具有重要意義。腫瘤細胞的神經(jīng)膜分化可能與其侵襲神經(jīng)有關(guān),而且通過神經(jīng)膜細胞標記物神經(jīng)細絲酸性蛋白(GFAP)免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)ACC的嗜神經(jīng)侵襲可能與ACC細胞發(fā)生了神經(jīng)膜細胞分化有關(guān),但由于光鏡觀察的局限性,究竟 ACC中是否存在神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的表達仍有待研究。務外神經(jīng)侵犯可能與腫瘤細胞向神經(jīng)主動運動有關(guān),而肌動蛋白(MA)則是目前細胞胞質(zhì)內(nèi)標記物,與細胞存在運動功能密切相關(guān),為了證實 ACC中的神經(jīng)膜細胞分化與肌上皮細胞的關(guān)系,本研究采用免疫電鏡技術(shù)從超微水平觀察 NSE和MA在ACC中的表達,為神經(jīng)侵犯的分子機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 14例 ACC標本取自本院 2007年 1月至 2007年 10月頜面外科住院手術(shù)患者,男性 8例,女性 6例,平均年齡 45.3歲;經(jīng)術(shù)前活檢病理證實,其中實體型 5例,篩狀型 6例,混合行 3例,神經(jīng)侵犯 1例;術(shù)中避開壞死區(qū)切取標本后立即固定于 0.05%戊二醛與 4%多聚甲醛中 2 h。

1.2 實驗步驟 標本固定 2 h后即進行振動切片,30%蔗糖沖洗液沖洗 4h,液氮凍融,0.1mol/LPBS緩沖液洗 30min,5%牛血清白蛋白和 5%羊血清封閉 1.5h,切片加入小鼠抗人 NSE多克隆抗體和小鼠抗人MA單克隆抗體后于常溫下過夜(一抗均用 5%牛血清白蛋白和 5%羊血清配制)。第 2天,0.1 mol/L PBS緩沖液洗 30 min后加入二抗(IgG2膠體金復合物),常溫下放置 1 d。第 3天,0.1 mol/L PBS緩沖液洗 30 min,2%戊二醛固定 45 min,去離子水洗 7次,銀加強,去離子水洗 7次,0.1mol/L PBS緩沖液洗30min,0.5%鋨酸固定 1 h,0.1 mol/L PBS緩沖液洗 30 min,梯度脫水,于EPON812環(huán)氧樹脂包埋劑中過夜。第 4天,EPON812環(huán)氧樹脂包埋,并于 37℃、45℃及60℃下各聚合 12、12、24 h。第 7天,光鏡下定位,超薄切片,切片厚度為 70nm,最后切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛復染后,電鏡下觀察。每例標本各取 2張切片分別采用 0.1 mol/L PBS緩沖液代替一抗作空白對照。

1.3 試劑和儀器 NSE多克隆抗體(DAKO,丹麥,工作濃度1∶50)、小鼠抗人 MA單克隆抗體 (DAKO,丹麥,工作濃度1∶50),日本電子 JEM2100型電子顯微鏡。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡觀察 光鏡下半薄切片觀察腫瘤細胞,可見大小不等的細胞巢或?qū)嵭膱F塊,部分標本上皮細胞巢內(nèi)有許多圓形腔隙,形成篩孔狀結(jié)構(gòu),有的腫瘤細胞形成實心團塊和篩狀兩種結(jié)構(gòu);MA陽性細胞和NSE陽性細胞均散在分布于腫瘤細胞巢中或環(huán)形分布于篩孔狀結(jié)構(gòu)的周邊,其中神經(jīng)侵犯的腫瘤細胞呈現(xiàn) MA和NSE的強陽性表達。

2.2 電鏡觀察 腫瘤主要由 2種形態(tài)不同的細胞組成,一類為立方狀細胞,細胞輪廓比較規(guī)則,胞核呈圓形和卵圓形,這類細胞 NSE和MA抗體均為陰性(圖 1)。另一類細胞形態(tài)多樣,有的呈多角形,有的呈梭形,多數(shù)均可見細長的胞質(zhì)突起,這類細胞多數(shù)能被抗 MA抗體和抗 NSE抗體所標記,MA陽性細胞的膠體金顆粒主要位于細胞質(zhì)中,它們多數(shù)具有梭形的細胞核以及細長的胞質(zhì)突起(圖 1)。NSE陽性細胞的膠體金顆粒同時位于細胞核與細胞質(zhì)內(nèi)(圖 1)。這類細胞的共同特征為細胞核形態(tài)不規(guī)則,多數(shù)呈梭形,與細胞質(zhì)突起的長軸平行,胞質(zhì)內(nèi)可觀察到平行的肌微絲結(jié)構(gòu)(圖 1)。

圖1 ACC細胞超微結(jié)構(gòu)

3 討 論

ACC是頜面外科常見的一種惡性腫瘤,盡管腫瘤細胞大多呈現(xiàn)高分化,卻極易侵襲神經(jīng),呈跳躍式轉(zhuǎn)移,臨床上常有面癱,感覺障礙等神經(jīng)受損癥狀,給臨床治療帶來很大困難。因此研究該腫瘤神經(jīng)侵犯和轉(zhuǎn)移機制意義重大。

NSE可從正常人腦中分離獲得,在星形神經(jīng)膠質(zhì)細胞及其腫瘤中存在,還見于各類型的星形細胞、膠質(zhì)母細胞瘤、髓母細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤以及一些具有神經(jīng)內(nèi)分泌功能的腫瘤中,并被用作神經(jīng)膜細胞的特異性標記物之一。ACC主要有兩種細胞來源導管內(nèi)襯上皮細胞和肌上皮細胞。究竟是ACC中哪種成分發(fā)生了神經(jīng)膜細胞分化,目前并不清楚。其中肌上皮細胞是一種兼具上皮和間葉組織結(jié)構(gòu)和功能表型的細胞,它屬上皮來源,但結(jié)構(gòu)與平滑肌類似,含有 MA,具有收縮功能,肌上皮細胞還含有微管結(jié)構(gòu),具有與神經(jīng)軸突某些相似的結(jié)構(gòu)特點,能參與神經(jīng)沖動的傳導,但目前并無肌上皮細胞出現(xiàn)神經(jīng)細胞樣分化的報道。Toth等〔1,2〕曾通過光鏡對比觀察 ACC和多形性低度惡性腺癌,認為ACC中某些腫瘤細胞和多形性低度惡性腺癌中變異的肌上皮細胞形態(tài)上與神經(jīng)膜細胞相似,提出這些細胞在腫瘤發(fā)生演變過程中發(fā)生了神經(jīng)膜細胞分化,但他既沒有進行肌上皮細胞的特異性染色,也沒有通過超微結(jié)構(gòu)辨認,這樣的結(jié)論顯然是沒有說服力的。我們研究顯示所有 14例標本均呈現(xiàn) NSE陽性表達,而且在神經(jīng)侵犯病例中出現(xiàn)高表達。因此我們證實腫瘤中有部分細胞出現(xiàn)了神經(jīng)分化,在篩狀的周邊尤為明顯。

MA是目前最常用的肌上皮細胞標記物,本實驗發(fā)現(xiàn)在ACC中,神經(jīng)膜細胞標記物NSE陽性細胞與MA陽性細胞具有相似的超微結(jié)構(gòu),這種超微結(jié)構(gòu)符合 Redman歸納的肌上皮細胞的超微結(jié)構(gòu)特點,即具有細長的細胞突起、梭形的細胞核、細胞核與細胞的長軸或最長的細胞突起平行、胞質(zhì)內(nèi)平行排列的微絲〔3～5〕。因此我們推測 ACC中發(fā)生神經(jīng)膜細胞分化的應該是其中的肌上皮細胞成分。而這些腫瘤性肌上皮細胞發(fā)生神經(jīng)膜細胞分化,表現(xiàn)出神經(jīng)膜細胞的某些特性,進而可以直接與神經(jīng)膜細胞表面受體識別結(jié)合,使ACC具有了嗜神經(jīng)侵襲的能力,同時腫瘤細胞仍保留肌上皮的運動特性,因此腫瘤細胞與神經(jīng)膜細胞黏附后會一直沿神經(jīng)束遷移,這可能是ACC嗜神經(jīng)侵襲的組織學基礎(chǔ)。

ACC的神經(jīng)侵犯特性可能與其他腫瘤在間質(zhì)中的浸潤轉(zhuǎn)移有相似之處,細胞間的黏附狀態(tài)會隨腫瘤發(fā)展的不同階段發(fā)生變化。最新研究顯示:ACC中肌上皮細胞的神經(jīng)分化可能表達多種神經(jīng)細胞表面的多種受體〔6,7〕,但受體的表達水平肯定隨神經(jīng)侵犯過程不斷發(fā)生變化,需要今后更加深入研究證實。

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