隱藏嗜酸菌DX1-1和氧化亞鐵硫桿菌CMS的紫外誘變育種及浸礦研究

楊宇，張帥, 徐愛玲, 鄒俐宏, 歷麗, 邱冠周

(中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院，生物冶金教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙，410083)

近年來，在極端環(huán)境下生長的微生物，由于其特殊的生理學(xué)和生態(tài)學(xué)的特征，受到了廣泛關(guān)注[1]，特別是能氧化礦物的微生物，它們能通過生理生化反應(yīng)利用礦物產(chǎn)生鐵離子和硫酸，后者是浸礦反應(yīng)中的關(guān)鍵因素[2]。這些微生物能夠利用鐵和硫的氧化產(chǎn)生能量，屬于化能自養(yǎng)的細(xì)菌或古菌[3]。迄今為止，在硫化礦坑廢水中僅得到了幾個種屬的具有鐵和硫氧化能力的細(xì)菌[4-5]，包括 Leptospirillum ferrooxidans,Acidithiobacillus ferrooxidans在內(nèi)的嗜酸[6]和耐酸自養(yǎng)菌屬以及嗜酸異養(yǎng)菌，其中，又以氧化亞鐵硫桿菌Acidithiobacillus ferrooxidans(At. ferrooxidans)的氧化能力最為突出，在自然界浸出硫化礦中扮演重要角色，被廣泛地應(yīng)用于生物濕法冶金[7-8]。相對而言，鐵的還原能力被認(rèn)為可以加快含鐵礦物如黃鉀鐵礬和針鐵礦的溶解。具有這種能力的細(xì)菌有中等嗜溫異養(yǎng)菌，如隱藏嗜酸菌Acidiphilium spp.，該菌不能氧化二價鐵[9]。又如Sulfobacillus spp.，該菌既不能氧化二價鐵又不能還原三價鐵[10]。所有的Acidiphilium spp.( Ac. cryptum.)都能通過異化作用使三價鐵還原成二價鐵，區(qū)別在于這種能力在一些菌株中是由結(jié)構(gòu)決定的，另一些則是誘導(dǎo)產(chǎn)生的[11]。浸出反應(yīng)常由上述氧化菌屬催化，但是產(chǎn)量較低。原因包括如下 3個方面：(1) 生長速率緩慢；(2) 細(xì)胞濃度低；(3) 三價鐵在氧化過程中被抑制[12]。這些不足亟需在生物浸出過程中得到解決。

誘變育種作為一種有效地提高微生物代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的手段得到了廣泛應(yīng)用，紫外線是一種非電離輻射，能使被照射物質(zhì)的分子或原子中的內(nèi)層電子提高能級躍遷到能量高的外層軌道(稱為激發(fā))，導(dǎo)致分子的理化變化。DNA分子上的堿基對強(qiáng)烈吸收紫外線，而且嘧啶比嘌呤敏感100倍。紫外線輻射能引起DNA鏈的斷裂、DNA分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)、核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，以及胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用等，但最主要的則是形成嘧啶二聚體，它會阻礙雙鏈的解鏈和復(fù)制，阻礙堿基的正常配對，從而導(dǎo)致基因突變。它的遺傳效應(yīng)主要是引起 GC→AT 的轉(zhuǎn)換或移碼突變[12]。在At. ferrooxidans的DNA中，AT堿基的含量為46%～47%[13]，而Ac. cryptum中AT堿基的含量為37%～40%，可能形成胸腺嘧啶二聚體，從而容易誘導(dǎo)產(chǎn)生突變。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基和菌種

本試驗(yàn)所用原始菌株 At. ferrooxidans CMS(DQO062118)和 Ac.cryptum DX1-1(DQ529311)由江西德興銅礦的酸性礦坑廢水(AMD)中分離得到[14]。在自然環(huán)境中，生長pH=2.0，溫度為21 ℃，細(xì)菌密度為6×109個/L，二價銅離子的質(zhì)量濃度為 0.1 g/L。表明這2株菌具有氧化含銅硫化礦的能力，并具有銅離子耐受能力。

9K 基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分(質(zhì)量濃度)如下：(NH4)2SO43 g/L， KCl 0.1 g/L， K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，Ca(NO3)20.01 g/L。

CMS所用9K發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為2.0 并加入4.5% FeSO4作為能源。

DX1-1所用9K發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為3.0，并加入1.5%葡萄糖作為能源。

9K固體培養(yǎng)基為 9K發(fā)酵培養(yǎng)基+1%瓊脂粉，pH=3.5～4.5。

1.2 活菌計數(shù)

連續(xù)稀釋培養(yǎng)基，在適宜菌體濃度下通過血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行鏡檢計數(shù)。

1.3 隱藏嗜酸菌DX1-1和氧化亞鐵硫桿菌CMS的紫外誘變

菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基里擴(kuò)大培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的菌體，洗滌，用無菌水制備成菌懸液，菌體密度N為107～108個/mL。取10 mL菌懸液放入9 cm平皿中，經(jīng)磁力攪拌后置于 15 W 紫外燈下 30 cm處進(jìn)行照射，照射時間分別為30, 60, 120, 180和240 s，設(shè)立平行對照組。各取1 mL溶液稀釋，涂9K平板計算致死率。另取1 mL溶液接種到添加了0.3% LiCl的9K發(fā)酵培養(yǎng)基。LiCl的作用是為了增強(qiáng)誘變效果。在4 ℃避光保藏12 h后，在30 ℃避光培養(yǎng)36 h。Ac. cryptum DX1-1的正突變率由傳代時間決定，At. ferrooxidans CMS的正突變率由亞鐵離子氧化率決定。At.ferrooxidans CMS的亞鐵離子氧化率通過在250 mL錐形瓶里加入 100 mL 9K基礎(chǔ)培養(yǎng)基+30 g/L FeSO4·7H2O (6.08 g/L Fe2+)，在 30 ℃，pH=2.0 條件下培養(yǎng)測定。在初始階段，每10 h取樣檢測Fe2+質(zhì)量濃度；在中后期，每3 h取樣檢測Fe2+質(zhì)量濃度。

1.4 礦樣

試驗(yàn)所采用的礦樣使用前經(jīng)過粉碎并用丙酮和乙醇洗滌[15]。礦樣成分(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為：CuFeS260.8%，F(xiàn)eS220.7 %，CaCO38.4%，SiO24.6%。

1.5 生物浸出試驗(yàn)

在250 mL錐形瓶里加入100 mL含硫化礦的 9K基礎(chǔ)培養(yǎng)基(在硫化礦浸出試驗(yàn)中不加入亞鐵)，礦含量為5%[16]。通過離心收集細(xì)菌，用硫酸調(diào)至pH=2.0的蒸餾水洗滌2次，再用9K基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮，不加入能量物質(zhì)，試驗(yàn)溫度為30 ℃，初始pH=2.5。設(shè)計6個試驗(yàn)組，每組做3個平行試驗(yàn)：(1) 培養(yǎng)基中接種誘變后Ac. cryptum DX1-1；(2) 培養(yǎng)基中接種誘變前At. ferrooxidans CMS；(3) 培養(yǎng)基中接種誘變后 At.ferrooxidans CMS；(4) 將誘變前2株菌按數(shù)量比1∶1混合接種；(5) 將誘變后2株菌按數(shù)量比1∶1混合接種；(6) 對照組(不接菌)。每種菌的接種量為1 mL，菌體密度為1×107個/mL左右， 同時調(diào)節(jié)搖瓶內(nèi)浸出環(huán)境。

1.6 分析方法

水樣的物化性質(zhì)分析由中南大學(xué)分析檢驗(yàn)中心測定，金屬離子用原子吸收光譜法測定，pH值由pH計(pHs-25)測定，銅離子在30 d內(nèi)的浸出量通過原子吸收光譜法測定，亞鐵離子的氧化率通過重鉻酸鉀化學(xué)滴定法測定，致死率通過平板計數(shù)法測定，Ac. cryptum DX1-1 和At. ferrooxidans CMS的正突變率分別由傳代時間和亞鐵離子的氧化率決定。

1.7 生物浸礦后期浸出液的微生物群落組成分析

1.7.1 DNA的提取和純化

將試驗(yàn)樣品浸出液通過孔徑為 0.2 μm的尼龍過濾器過濾收集細(xì)菌。DNA 提取使用 EZ-10 Spin Column Genomic DNA Isolation Kit (Bio Basic Inc) 試劑盒，純化使用 Wizard DNA Clean-Up Kit (Promega)試劑盒。

1.7.2 擴(kuò)增16S rRNA

采用2個引物擴(kuò)增16S rRNA基因片斷，上游引物為 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；下游引物為 1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。通過低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR結(jié)果，使用Wizard DNA Clean-Up Kit (Promega)試劑盒回收目的片斷。將16S rRNA基因片斷連接到PCR2.1 TOPO載體上，轉(zhuǎn)化到E. coli TOP10F感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)(Invitrogen)。轉(zhuǎn)化后重組菌涂LB瓊脂平板37 ℃過夜培養(yǎng)，LB瓊脂平板加入氨芐青霉素、X-gal和IPTG，通過藍(lán)白篩選，隨機(jī)挑取 60個白色菌落，使用載體引物M13F(5′-GTAAAACGACGGCCAGTG-3′)和 M13R(5′-GGAAACAGCTATGACCATG-3′)，將攜帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌破壁，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。

1.7.3 限制性片斷長度多態(tài)性分析(ARDRA)

16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) HindI和 MspI(Fermentas) 37 ℃酶切過夜，3.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外光下觀察 ARDRA結(jié)果，與文獻(xiàn)[17]中進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸性礦坑廢水的理化分析

酸性礦坑廢水成分如表1所示。從表1可見：硫的質(zhì)量濃度為4 401.00 mg/L，已經(jīng)被證實(shí)可以作為Ac.cryptum DX1-1的能源物質(zhì)[15]；Fe3+具有同樣功效，這也是Ac. cryptum DX1-1可以促進(jìn)生物浸出的主要原因。采集AMD樣品時，pH=2.0，溫度為21 ℃。

表1 酸性礦坑水成分分析Table 1 Composition of AMD ρ/(mg·L-1)

2.2 細(xì)菌的生理生化特征

pH值和溫度對Ac. cryptum DX1-1生長的影響如圖1所示，可見：最適pH=3.5，最適生長溫度為30 ℃。pH和溫度對At. ferrooxidans CMS生長的影響如圖2所示，可見：最適pH=2.0，最適生長溫度為30 ℃。由于2種菌有不同的最適pH值以及At. ferrooxidans CMS在浸礦中起主要作用，所以，在浸礦試驗(yàn)中取pH=2.5。

2.3 紫外誘變結(jié)果

2.3.1 Ac. cryptum DX1-1的紫外誘變結(jié)果

Ac. cryptum DX1-1的致死率和正突變率如表2所示。從表2可見：致死率與照射時間成正比，以細(xì)菌在穩(wěn)定期具有比原始菌株更大的菌體密度為正突變指標(biāo)。60 s時的致死率為75%，正突變率為16.7%，為最佳誘變時間。從正突變菌株中選取傳代時間最短的菌體用于浸出試驗(yàn)。

Ac. cryptum DX1-1誘變前和誘變后的生長曲線如圖3所示?？梢姡赫T變后正突變菌株達(dá)到穩(wěn)定期的時間為80 h，比原始菌株提前了20 h，菌體密度也由原來的109個/mL上升到1010個/mL。

圖1 pH值和溫度對Ac. cryptum DX1-1生長的影響Fig.1 Effects of pH and temperature on growth of strain Ac. cryptum DX1-1

圖2 pH值和溫度對At. ferrooxidans CMS生長的影響Fig.2 Effects of pH and temperature on growth of strain At. ferrooxidans CMS

表2 紫外誘變對Ac. cryptum DX1-1的影響Table 2 Effect of UV-induced mutagenesis on Ac. cryptum DX1-1

2.3.2 At. ferrooxidans CMS的紫外誘變效果

At. ferrooxidans CMS的致死率和正突變率如表3所示。從表3可見：At. ferrooxidans CMS的致死率與照射時間成正比，以細(xì)菌具有比原始出發(fā)菌更高的亞鐵氧化率為正突變指標(biāo)，60 s時的致死率為73%，正突變率為20.0%，因此，60 s為最佳誘變時間。

圖3 Ac. cryptum DX1-1誘變前和誘變后的生長曲線Fig.3 Growth curves of Ac. cryptum DX1-1 before and after UV-induced mutagenesis

表3 紫外誘變對At. ferrooxidans CMS的影響Table 3 Effect of UV-induced mutagenesis on At. ferrooxidans CMS

從正突變菌株中選取氧化亞鐵能力最強(qiáng)的菌株用于浸出試驗(yàn)。At. ferrooxidans CMS誘變前后的亞鐵氧化率曲線如圖4所示?？梢姡赫T變后的正突變菌株氧化全部亞鐵所需時間為 48 h，較誘變前菌株縮短了11 h。

圖4 At. ferrooxidans CMS誘變前后的亞鐵氧化率Fig.4 Fe2+ oxidation rates of strain At. ferrooxidans CMS before and after UV-induced mutagenesis

最佳的紫外照射時間取決于細(xì)菌自身的特性及基因的特異性，試驗(yàn)表明：對于At. ferrooxidans CMS 和Ac. cryptum DX1-1，采用低劑量的紫外誘變更為適合。因?yàn)橹懈邉┝孔贤庹T變會造成大量基因嚴(yán)重?fù)p傷，這些基因的功能得不到及時修復(fù)就會導(dǎo)致負(fù)突變產(chǎn)生。尤其在低溫避光條件下，修復(fù)酶的活性受到限制，細(xì)菌的繁殖速度同樣受到了抑制，使得突變菌被分離和純化。

2.4 生物浸出試驗(yàn)

黃銅礦作為酸溶性金屬硫化礦，易與三價鐵發(fā)生親核反應(yīng)而被溶解[18-21]。三價鐵氧化黃銅礦在溶液中生成銅離子、二價鐵離子和元素硫，反應(yīng)方程式如下：

At. ferrooxidans能夠氧化在浸礦過程中產(chǎn)生的亞鐵離子，反應(yīng)式如下：

At. ferrooxidans能夠?qū)⑸鲜鲞^程中產(chǎn)生的硫氧化，反應(yīng)式如下：

另外，在生物浸出過程中，也對電勢敏感，黃銅礦在硫酸溶液中的動力學(xué)原理如下：

硫在化學(xué)浸出過程中(式(1))形成，又在生物浸出過程(式(3))中被氧化。

從以上反應(yīng)中不難看出：At. ferrooxidans有利于反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行。在生物浸出的初始階段，需要向搖瓶內(nèi)加入硫酸使pH值維持在 2.5左右，提供所需的酸性環(huán)境；6 d以后，由于硫的氧化以及三價鐵水解成pH值會不斷下降。

在生物浸出過程中，會形成黃鉀鐵礬和硫的混合物，作為副產(chǎn)物在礦物表面形成一個層狀結(jié)構(gòu)，阻礙黃銅礦的溶解[23]。Acidiphilium能在很大程度上降低Fe3+-(氫)氧化物包括黃鉀鐵礬、鐵礬、無定型氫氧化鐵和混合Fe2+/Fe3+磁鐵礦的形成[11]。Acidiphilium的加入溶解了礦物表面致密的層狀結(jié)構(gòu)，有利于銅離子的持續(xù)浸出。

選用Ac. cryptum DX1-1和 At. ferrooxidans CMS浸出黃銅礦，結(jié)果如圖5所示?？梢姡涸谡麄€浸出過程中，銅離子的浸出質(zhì)量濃度持續(xù)上升，在前15 d，銅離子的浸出質(zhì)量濃度快速增大，在 16～30 d，質(zhì)量濃度增大速度減慢；前15 d是生物浸出銅的主要階段，銅離子質(zhì)量濃度大幅度上升，同時也產(chǎn)生了大量的黃鉀鐵礬和硫的混合物，阻礙了黃銅礦的溶解，因此，15 d后，銅離子的浸出趨于緩慢。接種了誘變后的Ac.cryptum DX1-1的浸出體系中，30 d后銅離子的質(zhì)量濃度為0.52 g/L。接種了誘變前的At. ferrooxidans CMS的浸出體系中，30 d后銅離子的質(zhì)量濃度為1.82 g/L，誘變后的體系中為 1.89 g/L。接種了誘變前的 At.ferrooxidans CMS 和 Ac. cryptum DX1-1(數(shù)量比為 1∶1)的浸出體系中，浸出30 d后銅離子的質(zhì)量濃度為2.48 g/L，誘變后的混合體系中，30 d后銅離子的質(zhì)量濃度達(dá)到 2.78 g/L。紫外誘變育種有助于提高 At.ferrooxidans的亞鐵氧化活性，有利于生物浸出。

圖5 不同浸出體系Cu2+質(zhì)量濃度Fig.5 Cu2+ concentrations extracted in different systems

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，使用2種菌混合浸礦的效果大于2種菌單獨(dú)浸礦效果，說明混合浸出是一個相互促進(jìn)的過程。Ac.cryptum 加快了還原溶解黃鉀鐵礬和針鐵礦，并且消耗了抑制At. ferrooxidans生長的有機(jī)化合物，促進(jìn)了At. ferrooxidans的浸礦過程。由于Ac. cryptum不能氧化亞鐵[24]，所以，它單獨(dú)浸礦的效果最差。

2.5 生物浸出后浸出液內(nèi)生物群落結(jié)構(gòu)分析

在生物浸出反應(yīng)的初始階段，Ac. cryptum DX1-1和At. ferrooxidans CMS具有相同的細(xì)胞濃度。浸出30 d后，在接種了誘變前混合菌的浸礦體系中，經(jīng)過限制性片斷長度多態(tài)性(ARDRA)分析，浸出液中 Ac.cryptum DX1-1和At. ferrooxidans CMS的數(shù)量比約為1∶20，在相同條件下，接種了誘變后混合菌的浸出礦體系中，它們的數(shù)量比為1∶18。這證明了Ac. cryptum不是浸礦過程的優(yōu)勢菌，只占菌落結(jié)構(gòu)的小部分，協(xié)助At. Ferrooxidans起浸礦作用。因此，可以在以后的試驗(yàn)設(shè)計中更多考慮有利于 At. Ferrooxidans浸礦的因素，并在浸出體系中接種少量的Ac. cryptum。

3 結(jié)論

(1) 試驗(yàn)中所選用的 Ac. cryptum DX1-1 和 At.ferrooxidans CMS的最適生長溫度均為 30 ℃，最適pH值分別為3.5和2.0。

(2) 紫外誘變 Ac. cryptum DX1-1和 At.ferrooxidans CMS最佳時間為60 s，正突變率分別達(dá)到16.7%和20.0%。誘變后的Ac. cryptum DX1-1達(dá)到穩(wěn)定期的時間比誘變前縮短了20 h，并且具有更大的菌體濃度。誘變后的At. ferrooxidans CMS較誘變前具有更強(qiáng)的氧化亞鐵能力，將氧化全部亞鐵所需時間縮短了11 h。

(3) 誘變后的 At. ferrooxidans CMS 和 Ac.cryptum DX1-1(數(shù)量比為1∶1)混合浸礦，30 d后銅離子質(zhì)量濃度達(dá)到2.78g/L，優(yōu)于At. ferrooxidans CMS單獨(dú)浸礦或誘變前混合菌的浸礦效果。Ac. cryptum單獨(dú)浸礦的效果最差。

(4) 浸出 30 d后，Ac. cryptum DX1-1和 At.ferrooxidans CMS的數(shù)量比由1∶1變?yōu)?∶20左右，為以后的生物浸礦試驗(yàn)設(shè)計提供了科學(xué)依據(jù)。

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