肝病實驗室診斷

徐京昕

(北京大學醫(yī)院 檢驗科,北京100871)

1 肝臟結(jié)構(gòu)功能特點及肝病實驗室診斷技術(shù)

1.1 肝臟結(jié)構(gòu)功能特點

肝臟具有生物合成、生物解毒、排泄和免疫功能。肝臟有肝動脈和門靜脈雙重血液供應(yīng),有豐富的血竇,有兩條輸出通路-肝靜脈和膽道系統(tǒng),肝細胞內(nèi)含有數(shù)百種酶?？梢鸶窝椎牟《居屑?、乙、丙、丁 、戊 、庚型肝炎病毒(HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HGV)。

1.2 肝病實驗室檢測技術(shù)

生化技術(shù):酶促速率分析法、干化學法、層析技術(shù)、光譜技術(shù)、色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)。免疫標記技術(shù):酶免分析法、化學發(fā)光法、電化學發(fā)光法、熒光標記法和放免技術(shù)、流式細胞技術(shù)、時間分辨技術(shù)。分子生物學技術(shù):PCR、雜交和生物芯片技術(shù)(基因芯片技術(shù)、蛋白芯片技術(shù))。

2 實驗室檢測項目的臨床應(yīng)用

2.1 生化指標的臨床應(yīng)用

指示肝實質(zhì)細胞膜通透性病變試驗:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、乳酸脫氫酶(LDH)、腺苷脫氨酶(ADA)等活性增高。

指示肝細胞壞死試驗:谷氨酰脫氫酶(GDH)、AST/ALT增高。

指示肝內(nèi)或肝外膽道阻塞試驗:堿性磷酸酶(ALP)、L-γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)、LAP 、5′-核苷酸酶(5′-NT)、膽汁酸(TBA)增高。

指示肝實質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成機制障礙試驗:總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)、膽堿酯酶(ChE)、凝血因子、纖維蛋白元(FIB)下降。

指示肝臟間質(zhì)成分增生試驗:蛋白電泳球蛋白增加、纖維化指標β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)和血清單胺氧化酶(MAO)增高。

指示肝臟惡性疾病試驗:ALP、GGT-II、LDH、甲胎蛋白(AFP)、α-L-巖藻糖苷酶(AFU)增高。

2.1.1 肝病出凝血實驗室指標-凝血因子 肝臟疾病,最多和最先減少的是因子VII,其次和中度減少的是因子II和Ⅹ,最后和最少減少的是因子V。

2.1.2 肝臟分泌功能指標-膽汁酸(TBA)TBA的測定,對肝膽疾病的診斷其敏感性達76%,特異性達93%。TBA測定對急性肝炎早期診斷的價值與ALT和AST測定相同,但ALT和AST隨肝細胞損害的控制很快轉(zhuǎn)為正常,而TBA則逐漸轉(zhuǎn)為正常。TBA持續(xù)較高水平的患者往往慢性歸轉(zhuǎn)。TBA測定對檢測酒精或工業(yè)化學品引起的肝細胞損傷的靈敏度優(yōu)于其他肝功能試驗。此外,TBA測定對肝外膽管阻塞和肝內(nèi)膽汁淤積的診斷具有較高的靈敏度,包括膽管阻塞、膽汁性肝硬化、新生兒膽汁淤積和妊娠性膽汁淤積。

2.1.3 肝臟解毒功能指標-膽紅素(BIL)肝損傷時,影響了肝臟對膽紅素的攝取、轉(zhuǎn)化、排泄功能,造成血中結(jié)合與未結(jié)合膽紅素均增加-黃疸。病毒性肝炎、中毒性肝炎或肝癌、肝內(nèi)或肝外膽道阻塞、新生兒生理性黃疸等膽紅素增高。肝臟對膽紅素和膽汁酸有不同的運轉(zhuǎn)系統(tǒng),可鑒別膽汁淤滯和高膽紅素血癥。

2.1.4 肝臟合成功能指標-TP、ALB和PA 肝臟功能嚴重損害時,蛋白質(zhì)合成減少,以白蛋白的下降最為顯著。PA是肝功能障礙的一個敏感指標,對肝病的早期診斷有一定的價值。

2.1.5 肝病酶學實驗室指標 肝細胞血清酶活性異常機制:細胞及細胞器受損,酶外溢;肝細胞合成功能降低,酶合成量減少;膽道排泄受阻,造成酶堆積;癌細胞逆向合成活躍,某些酶蛋白合成增加。常用指標:ALT、AST、ChE、ALP、GGT。新應(yīng)用指標:GDH 、ADA 、LAP、5′-NT 、AFU 、MAO 。

①轉(zhuǎn)氨酶臨床意義 ALT和AST在傳染性肝炎、肝癌、中毒性肝炎、脂肪肝和膽管炎時都增高,可用于判斷病情,輔助鑒別診斷,并可監(jiān)控療效及判斷預(yù)后。

②ChE臨床意義 ChE在肝實質(zhì)細胞損害時由于合成減少而降低,對早期肝硬化診斷有價值,對病毒性肝炎預(yù)后也有意義。

血清酶在各種肝病中的活性(U/L)

③ALP臨床意義 ALP是肝膽疾病的臨床輔助診斷指標,在阻塞性黃疸、急性或慢性黃疸性肝炎、肝癌時都增高。

④GGT臨床意義 GGT主要診斷肝膽疾病。原發(fā)性肝癌、胰腺癌和乏特壺腹癌時,GGT顯著增高,特別在診斷惡性腫瘤患者有無肝轉(zhuǎn)移和肝癌術(shù)后有無復(fù)發(fā)時,陽性率可達90%。但作為肝癌標志物的特異性較差,急性肝炎、慢性肝炎活動期、阻塞性黃疸、膽道感染、膽石癥、急性胰腺炎時都可增高。

⑤LDH臨床意義 LDH常用于心肌梗死、肝病和某些惡性腫瘤的臨床診斷。

⑥ADA臨床意義 ADA活性增高,常見于肝炎、肝硬化、腫瘤引起的阻塞性黃疸。

⑦MAO臨床意義 MAO活性測定是檢查肝纖維化病變的重要指標。MAO-Ⅰ活性增高主要見于肝硬化和肢端肥大癥,而MAO-Ⅱ活性增高主要見于大塊肝壞死。爆發(fā)性肝炎、重癥肝細胞壞死時,線粒體的MAO釋放,血液中酶活性增高,陽性率可達73%以上。

⑧5′-NT 臨床意義 5′-NT 活性增高主要見于肝膽系統(tǒng)疾病,如阻塞性黃疸、原發(fā)及繼發(fā)性肝癌等。通常酶活性變化與ALP活性變化相平行。在骨骼系統(tǒng)疾病中,通常ALP增高,而5′-NT正常,測定5′-NT有助于臨床判斷ALP增高原因是肝膽系統(tǒng)疾病,還是骨骼系統(tǒng)疾病。

⑨NAG臨床意義 NAG在肝硬化和慢性活動性肝炎晚期,肝組織有纖維化時增高,中晚期妊娠時亦見增高。

⑩AFU臨床意義 慢性肝炎和肝硬化患者AFU增高,但一般僅輕度增高,且隨疾病的治愈和好轉(zhuǎn)而下降。原發(fā)性肝癌(PHC)患者AFU持續(xù)升高,幅度較大。AFU不僅顯著高于正常對照,也顯著高于轉(zhuǎn)移性肝癌、膽管細胞癌、肝硬化、先天性肝囊腫和其他良性肝占位性病變。AFU的敏感性高于甲胎蛋白(AFP),特異性差于AFP,AFU與AFP無起明顯相關(guān),二者聯(lián)合檢測可提高肝癌的檢出率,特別是對AFP陰性和小細胞肝癌的診斷價值更大。AFU還可作為PHC術(shù)后監(jiān)測、追蹤觀察的較理想指標,其變化與病情嚴重程度相平行,且早于臨床表現(xiàn)1-2個月。

2.1.6 肝昏迷指標-氨 正常情況下,氨在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)變成尿素,嚴重肝臟疾病時,氨不能從循環(huán)中清除,引起血氨增高。高血氨有神經(jīng)毒,引起肝性腦病。血漿氨測定主要用于肝昏迷的監(jiān)測和處理。

2.2 病毒性肝病病原學檢測項目的臨床應(yīng)用

病毒性肝病病原學指標:抗原抗體檢測:HAVHGV抗原抗體。病毒核酸檢測:HBV DNA、HCV RNA、HGV RNA。病毒基因分型與突變:HBVYMDD變異、HCVRNA分型。

2.2.1 甲型肝炎病原學檢測意義 抗HAV-IgM陽性是早期診斷甲型肝炎的指標,表示急性期(感染初期,3個月后滴度下降,6-8個月已不易檢出);抗HAV-IgM陰性而抗HAV-IgG陽性提示既往感染HAV。急性期和恢復(fù)期雙份血清抗HAV總抗體滴度升高≥4倍;血清或糞便中檢出HAV RNA。

2.2.2 乙型肝炎病原學檢測意義 HBsAg由S基因編碼,是HBV的衣殼蛋白,包括S、前S1和前S2蛋白,是HBV感染的主要標志。是急性乙型病毒性肝炎第一個出現(xiàn)的標志物,HBsAg陽性小于6個月為急性肝炎、大于6個月為慢性肝炎。極少數(shù)情況下,“a”決定族的變異株可以逃逸抗HBs抗體的檢測,可能造成假陰性漏檢。

抗HBs陽性一般表示病毒已清除。但已有報道抗HBs出現(xiàn)后血清內(nèi)仍有DNA復(fù)制,尤其急性乙型肝炎感染窗口期抗HBs與HBV DNA同時陽性,但通常HBV DNA檢出率逐步下降。是HBV疫苗免疫后唯一出現(xiàn)的指標。

HBeAg由C基因編碼,是HBV核心的可溶性抗原,HBeAg陽性表示病毒在體內(nèi)復(fù)制,傳染性較強。HBeAg陽性與HBV DNA有顯著相關(guān)和HBsAg差不多同時出現(xiàn)。HBeAg陰轉(zhuǎn)往往是HBV病毒血癥的消失或炎癥的靜息。一般認為HBeAg消失和抗HBe出現(xiàn)是乙型慢性肝炎好轉(zhuǎn)穩(wěn)定的征象,但并不意味著HBV DNA停止復(fù)制或傳染性消失,尤其在另一部分感染者中如重型肝炎患者,主要以HBcAg的表達為主,感染起始即為HBeAg陰性。HBeAg向抗HBc抗體轉(zhuǎn)換是抗病毒藥物療效評價指標。

抗HBc是HBcAg的相應(yīng)抗體,是HBV感染后血清中最早出現(xiàn)的標志性抗體,幾乎所有個體在接觸HBV后都能產(chǎn)生抗HBc,是流行病學調(diào)查的良好指標。接觸HBV抗原者,血清中可出現(xiàn)低滴度抗HBc抗體,只有進行連續(xù)檢測,抗體滴度逐漸升高,或抗體滴度達10000以上時,抗HBc才可作為感染指標。抗HBc有IgG、IgM、IgA三類,IgM類和IgA類抗HBc在乙肝急性期或慢性肝炎活動期出現(xiàn)。在HBV感染的“窗口期”,抗HBc常常是唯一可測出的HBV血清標志物。

HBV DNA與HBV感染者病情和預(yù)后的關(guān)系密切,尤其是急性和慢性乙型肝炎患者,是目前病毒檢測的金標準。HBV DNA陰性提示外周血中已經(jīng)沒有病毒存在,在抗HBs和抗HBc陽性的某些病例中可檢測到HBV DNA的存在。HBV DNA一直保持較高水平的急性肝炎患者易慢性化,而HBV復(fù)制水平較高的慢性肝炎患者不僅對干擾素治療的反應(yīng)性差,而且肝組織炎癥反應(yīng)更明顯,病情更重,更易發(fā)生肝硬化和肝癌。中國慢性乙肝病人治療的目的主要就是降低血清HBV DNA,同時HBV DNA滴度的動態(tài)變化還可在臨床上用于觀察抗病毒藥物療效,指導(dǎo)用藥。

2.2.3 丙型肝炎病原學檢測意義 我國輸血后肝炎中60%-80%、散發(fā)性急性肝炎中12%-24%為丙型肝炎。人體感染HCV后臨床癥狀一般較輕,但70%-85%患者發(fā)展成慢性肝炎,感染20-30年后10%-20%發(fā)展成肝硬化,另有1%-5%可發(fā)展成原發(fā)性肝癌。

血清ELISA檢測抗HCV-IgG抗體:作為篩查和診斷?？笻CV抗體陽性而血清中沒有HCV RNA提示既往感染,有極少數(shù)病例抗HCV陰性但可檢測到HCV RNA,還有某些慢性HCV感染者的抗HCV可持續(xù)存在。

重組免疫印跡試驗(RIBA)檢測抗HCV-IgG抗體:作為丙肝確認試驗。

HCV RNA定量PCR測定:由于個體間免疫功能的差異,部分患者出抗-HCV較晚,免疫功能低下者和經(jīng)免疫抑制治療者甚至可能不產(chǎn)生抗-HCV,因此HCV RNA是HCV感染的確診標志,即使在“窗口期”,也可檢測出HCV RNA,還可指導(dǎo)用藥,為療效觀察及預(yù)后判斷提供客觀指標。

2.2.4 丁型肝炎病原學檢測意義 丁型肝炎病毒抗原(HDV-Ag):HDV-Ag主要存在于受感染的肝細胞核和胞質(zhì)內(nèi),在血清中出現(xiàn)較早,持續(xù)時間僅1-2周,如檢測不及時,往往呈陰性。

抗HDV-IgM:抗HDV-IgM 出現(xiàn)是一過性的,為HDV和HBV同時感染;抗HDV-IgM持續(xù)升高或隨肝損傷波動者,為HDV和HBV重疊感染,同時它也是慢性活動性HDV感染的指標。連續(xù)檢測抗HDVIgM可估計慢性丁型肝炎的預(yù)后。如抗HDV-IgM升高的同時伴有肝功能異常,提示病情惡化。

抗HDV-IgG:抗HDV-IgG一般在感染6周以后出現(xiàn),慢性感染的發(fā)展與抗HDV-IgG的高滴度持續(xù)存在有關(guān)。該滴度在整個病程中持續(xù)不變,是慢性感染的指標。而低滴度的抗HDV-IgG則是HDV既往感染的指標。

HDV RNA:血清HDV RNA是直接證實HDV感染和病毒復(fù)制活動的指標,檢測應(yīng)用發(fā)現(xiàn)血清抗HDV-IgM陽性者有較高的HDV RNA檢出率。對各型乙型肝炎患者HDV RNA的檢測,重型肝炎檢出率較高,其次為肝硬化。

2.2.5 戊型肝炎病原學檢測意義 戊型肝炎病毒抗原(HEV-Ag):HEV感染者的糞便或膽汁中可查出HEV-Ag,結(jié)合臨床診斷為戊型病毒性肝炎。戊型病毒性肝炎患者糞便的陽性率僅為21%左右。

抗HEV-IgM和抗HEV-IgG:抗HEV-IgG在戊肝急性期即可檢出,且滴度較高,持續(xù)約6個月,抗HEV-IgM通常滴度不高,持續(xù)約2個月?？笻EVIgM和抗HEV-IgG均陽性,現(xiàn)癥感染期或恢復(fù)期早期;抗HEV-IgM陽性,抗HEV-IgG陰性,HEV感染早期、急性期;抗HEV-IgM陰性,抗HEV-IgG陽性,HEV繼往感染或恢復(fù)后期。還有17.8%的患者兩種抗體均為陰性。

HEV RNA:血清、膽汁、糞便中檢出HEV是診斷急性戊型肝炎最特異的指標;急性期患者血清的陽性率約為70%左右。

2.2.6 庚型肝炎病原學檢測意義 HGV感染血清標志物主要有特異性HGV抗體(抗-HGV)和HGV RNA。凡ELISA法檢測到抗HGV陽性者,可診斷為現(xiàn)癥或過去已感染過庚肝病毒。

2.2.7 前S蛋白/抗前S蛋白臨床意義 是病毒附著于肝細胞膜上最重要的介導(dǎo)部位蛋白的氨基酸(AA)21-47片段;變異的病毒只要一區(qū)段完好就有傳染性;主要存在于血清中完整HBV表面。出現(xiàn)在急性HBV感染的最早期,是病毒清除的最早跡象;前S1病毒蛋白與HBV DNA、HBeAg高度相關(guān);在抗HBe陽性的HBV感染者中,檢出前S1蛋白可表明病毒的復(fù)制。

2.3 自身免疫性肝病檢測項目的臨床應(yīng)用

2.3.1 抗核抗體(ANA)檢測意義 ANA對很多自身免疫性疾病有診斷意義,對慢性活動性肝炎也有20%-50%的檢出率。

2.3.2 抗ENA抗體檢測意義 抗ENA抗體中的抗SS-A/Ro抗體可見于20%的原發(fā)性膽汁性肝硬化,偶見于慢性活動性肝炎。

2.3.3 抗組蛋白抗體檢測意義 在非風濕性自身免疫疾病中,原發(fā)性膽汁性肝硬化患者約有76%抗組蛋白抗體陽性。

2.3.4 抗線粒體抗體(AMA)檢測意義 靶抗原是真核細胞線粒體膜上的多種蛋白,現(xiàn)知有M1-M9共9種成分?？筂2 AMA對原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)患者的特異性為97%,敏感性為95%-98%。高滴度的抗M2抗體是PBC的標志,但AMA與PBC的病期、疾病嚴重程度、治療效果和預(yù)后均無明確關(guān)系?？筂2抗體還見于其他慢性肝病,如慢性活動性肝炎(CAH)及 HbsAg陰性的肝病(陽性率為30%),還有進行性全身性硬化癥(陽性率為7%-25%),但均以低滴度為主。

2.3.5 抗肝抗原自身抗體檢測意義 抗肝抗原自身抗體有多種,包括抗肝特異性脂蛋白(LSP)抗體、抗肝細胞膜抗原(LMA)抗體、抗線粒體抗體(AMA)、抗肝腎微粒體(LKM)抗體、抗平滑肌抗體(ASMA)和抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(SLA/LP)抗體等。這些自身抗體在區(qū)分病毒性肝炎及三型自身免疫性肝炎(AIH)中具有重要意義。如Ⅰ型AIH可檢測到ANA和抗LMA抗體;Ⅱ型AIH的特征性抗體是抗LKM-1抗體;Ⅲ型AIH的特征性抗體是抗SLA/LP抗體。

2.3.5.1 抗肝特異性脂蛋白(LSP)抗體檢測意義陽性主要見于急性、慢性病毒性肝炎和慢性活動性自身免疫性肝炎。該抗體在不同人群中的陽性率如下:自身免疫性肝炎活動期為50%-100%;急性病毒性肝炎為11%-93%;慢性病毒性乙型肝炎為28%-93%;慢性病毒性丙型肝炎為0%-10%;隱匿性肝硬化為20%-38%;原發(fā)性膽汁性肝硬化為33%-51%;酒精性肝病為0%-36%;其他肝病為0%-17%;非肝性自身免疫疾病為0%-18%。

2.3.5.2 抗肝細胞膜抗原(LMA)抗體檢測意義抗LMA抗體在不同人群的陽性率為:在Ⅰ型自身免疫性肝炎活動期為35%-100%;急性病毒性肝炎為0%-17%;;慢性病毒性乙型肝炎為0%-16%;隱匿性肝硬化為0%-61%;原發(fā)性膽汁性肝硬化為0%-42%;酒精性肝病為0%-27%;其他肝病為0%-4%;非肝性自身免疫病為0%-4%?？筁MA與抗LSP抗體不同,更多見于原發(fā)性自身免疫性肝炎患者?？赡芡ㄟ^抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒反應(yīng)和補體介導(dǎo)的細胞毒作用造成肝細胞的損傷。

2.3.5.3 抗肝腎微粒體(LKM)檢測意義 抗LKM-1是Ⅱ型AIH的標志性抗體,也見于2%-10%的慢性丙型病毒性肝炎患者。

2.3.5.4 抗平滑肌抗體(ASMA)檢測意義 SMA為Ⅰ型AIH的標志抗體。在自身免疫性肝病患者中的檢出率可達90%。高滴度的SMA對診斷AIH的特異性幾乎達到100%,低滴度的SMA見于酒精性肝硬化和病毒性肝炎。

2.3.5.5 抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(SLA/LP)抗體檢測意義 抗SLA/LP抗體是Ⅲ型AIH最特異的指標。抗LKM/LP抗體陽性的AIH患者ANA、SMA和抗LKM-1多為陰性,其陽性率僅約30%,但其陽性預(yù)測值幾乎為100%。

2.3.5.6 抗Sp-100抗體(抗核顆?？贵w)檢測意義

原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種慢性炎性肝病,最初為小到中等大小的膽管發(fā)炎,并逐漸轉(zhuǎn)化為進行性組織病變,最后是嚴重的肝硬化?？筍p-100抗體可在31%的PBC病人中檢測到,尤其在AMA陰性的PBC病人中,其檢測率為48%,其他的自身免疫性肝病患者此抗體陰性。

2.3.5.7 抗去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)抗體檢測意義 抗ASGPR抗體在AIH陽性率可達50%,治療前或活動期患者可達88%,該抗體可見于各型AIH患者,該抗體水平下降或消失表示治療有效,升高則表示病情復(fù)發(fā)。

2.3.5.8 抗肝細胞溶質(zhì)抗原1型(LC-1)抗體檢測意義 抗LC-1抗體為Ⅱ型AIH的特異性抗體,陽性率為56%-72%。多見于小于20歲的患者,大于40歲的患者少見?？筁C-1抗體水平與Ⅱ型AIH患者的疾病活動性密切相關(guān),常與抗LKM-1抗體同時存在,但特異性優(yōu)于抗LKM-1抗體。

2.4 實驗室檢測項目的臨床應(yīng)用

2.4.1 急性病毒性肝炎

篩選:ALT、膽紅素。確定病因:HbsAg、抗HbcIgM、抗HAIgM、抗HCV。估計病情和預(yù)后:白/球蛋白 、IgG 、IgA、IgM,凝血酶原時間 。

2.4.2 慢性肝炎

篩選 :ALT、AST、ChE、BIL、白/球蛋白 、蛋白電泳。確定病因:HbsAg(陽性則HbeAg、抗Hbe、抗HbcIgM)、抗 HCV、抗HDV、抗平滑肌抗體、抗核抗體。估計病情和預(yù)后:免疫球蛋白、凝血酶原時間。

2.4.3 肝纖維化實驗室指標

膠原:III型前膠原肽;III型前膠原;IV型膠原;I型膠原;IV膠原肽。肽酶:脯氨酸羥化酶、脯氨酸肽酶。非膠原蛋白:層粘連蛋白;透明質(zhì)酸。細胞因子:血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)、轉(zhuǎn)化生長因了 β、TGF-β、GTGF 結(jié)締組織生長因子 、TNF 和INF。

2.4.4 肝硬化

血清蛋白成分的異常;血清膽紅素升高;血清酶學指標的改變;凝血酶原時間延長、活動度降低。

2.4.5 原發(fā)性膽汁性肝硬化

篩選:ALT、BIL、ALP、IgM 。確診:抗線粒體抗體(M2)、肝活檢。

2.4.6 原發(fā)性肝癌

篩選:AFP、ALP-Ⅰ、γ-GT同工酶Ⅱ。其他癌指標:鐵蛋白、α-1抗胰蛋白酶、異常凝血酶原。