浸潤性乳腺癌中hRad17和MCM7的表達及臨床病理意義

田秀春,范欽和,顧學(xué)文,王翠梅

(1.江蘇省蘇北人民醫(yī)院病理科,江蘇揚州,225001;2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科,江蘇南京,210029)

hRad17基因是1988年[1]發(fā)現(xiàn)的一種細胞周期檢測點基因,近年來越來越多的研究表明,hRad17基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。MCM7蛋白是真核細胞DNA復(fù)制所必需的分子。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測hRad17和MCM蛋白在乳腺癌組織及良性病變中表達情況,并結(jié)合各項臨床病理資料,旨在進一步探討hRad17和MCM7蛋白在乳腺癌中的表達意義及相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集江蘇省蘇北人民醫(yī)院 2003年1月～2004年8月浸潤性乳腺癌標本90例及20例良性病變標本20例。手術(shù)標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定,取材后常規(guī)包埋切片,連續(xù) 4 μ m 厚切片。浸潤性乳腺癌按照世界衛(wèi)生組織WHO乳腺癌分類分級標準[2]進行病理學(xué)分類分級:90例中,浸潤性導(dǎo)管癌70例,浸潤性小葉癌10例,髓樣癌5例,其他5例。組織學(xué)分級:Ⅰ級15例,Ⅱ級46例,Ⅲ級29例?；颊吣挲g35～81歲,平均51歲。所有患者術(shù)前均未接受內(nèi)分泌治療或化療。

1.2 試劑

hRad17購自Santa Cruz公司,MCM7購自Neo Marker公司。

1.3 免疫組化染色

采用免疫組化S-P法,切片經(jīng)脫蠟、梯度乙醇脫水后到蒸餾水,然后經(jīng)枸櫞酸液高溫高壓抗原修復(fù),用10%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min,PBS液沖洗3次×2 min,滴加hRad17(原液按 1:75稀釋)和 MCM7(原液按 1:200稀釋)過夜,PBS液沖洗3次×2 min,20%蛋清液封閉內(nèi)源性生物素30min,PBS液沖洗3次×2 min,滴加二抗,孵育30 min,PBS液沖洗3次×2 min,用DAB顯色。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷

hRad17、MCM7標記均以細胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞。癌細胞無著色或陽性腫瘤細胞數(shù)<10%為(-);陽性腫瘤細胞數(shù)10%～30%為(+);陽性腫瘤細胞數(shù) 30%～70%為( );陽性腫瘤細胞數(shù)>70%為( )。

2 結(jié) 果

乳腺良、惡性病變中hRad17和MCM7蛋白的表達見表1。

表1 hRad17和MCM7各組中的表達

在90例浸潤性乳腺癌組織中,hRad17的陽性表達率為62.2%,MCM 7的陽性表達率為84.4%,2種蛋白表達呈正相關(guān),見表2。

表2 90例潤性乳腺癌中 hRad17和MC M7的表達

hRad17和MCM7在Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級浸潤性乳腺癌中陽性表達率分別為6.7%、30.0%、25.6%和 12.2%、41.1%、31.1%,在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中陽性表達率分別為36.7%和45.6%,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中陽性表達率為25.6%和38.7%。hRad17和MCM7的表達與乳腺癌病理學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亦呈正相關(guān),見表3、4。

表3 hRad17和MCM7在各級浸潤性乳腺癌中的表達

表4 hRad17和MCM7表達與浸潤性乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

3 討 論

腫瘤是一類多步驟發(fā)生的、多基因突變所致的細胞克隆性、進化性疾病,也是一種細胞周期性疾病。細胞周期不同時相間存在著類似“關(guān)卡”式的關(guān)鍵調(diào)控點(即檢測點),以保證各個細胞周期事件的啟動、完成等忠實地按序進行。細胞周期檢測點對維護真核生物向下一代傳送遺傳信息的高保真來說是必需的。

hRad17基因是Parker等[1]于 1988年發(fā)現(xiàn)克隆并命名。其位于5號染色體短臂[3],為粟酒酵母rad17和釀酒醇母rad24的同源基因,是一個重要的細胞周期檢測點基因。其編碼的檢測點蛋白hRad17蛋白是具有670個氨基酸的堿性親水蛋白[1]。hRad17主要參與細胞的G2/M 期阻滯,防止損傷的DNA傳到子代細胞。hRad17蛋白結(jié)合在染色質(zhì)上,在發(fā)生DNA損傷后,感知DNA的損傷,通過類似RFC/PCNA樣作用動員PCNA樣rad9-rad1-hus1檢測點蛋白復(fù)合體(即9-1-1檢測點復(fù)合體)結(jié)合到染色質(zhì)上,從而激活蛋白激酶AT R/ATM,使下游檢測點蛋白及hRad17蛋白發(fā)生磷酸化,這一過程為DNA損傷介導(dǎo)的細胞周期G2期捕獲,從而有利于損傷的DNA修復(fù)[4-5]。

微小染色體維持蛋白(MCM)是20世紀80年代Bik-Kwoon Tye在突變的酵母中發(fā)現(xiàn),然后通過分子和生物學(xué)實驗方法分離提取出來的。它由至少6個亞單位組成,包括MCM2、MCM3、MCM4/Cdc21、MCM5/Cdc46、 MCM6/Miss5、MCM7/Cdc47,存在于所有真核細胞中。

MCM7為DNA復(fù)制許可復(fù)合體MCM的關(guān)鍵成員,在控制DNA復(fù)制的起始過程中起關(guān)鍵作用[6]。在M 晚期到G1早期,當(dāng)MCM7和其它分子結(jié)合到復(fù)制起始點處,才能夠啟動DNA聚合酶復(fù)制DNA過程的開始。S期MCM復(fù)合體離開復(fù)制起始點,保證DNA復(fù)制在一個細胞周期中只有1次。MCM還是DNA復(fù)制與延長時的螺旋酶,在復(fù)制點及復(fù)制延長階段解開DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),為DNA復(fù)制提供單鏈模板[7]。

本實驗 MCM7在浸潤性乳腺癌中的表達(84.4%)明顯高于良性乳腺病變組(30.0%),有顯著差異(P<0.01)。MCM7蛋白的高表達不僅使細胞進入增殖周期,促進細胞增殖活性,而且使異常物質(zhì)在細胞內(nèi)堆積,引起染色體畸變,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[8]。

本實驗hRad17在浸潤性乳腺癌中的表達(62.2%)明顯高于良性乳腺病變組(10.0%),有顯著差異(P<0.01)。其在乳腺癌中過度表達的原因及后果還不確定。

可能是 hRad17的 Ser635和 Ser645位點被ATR/ATM磷酸化后才能發(fā)揮檢測點功能。DNA損傷時,野生型hRad17過表達細胞出現(xiàn)G2/M 期捕獲,而突變型 hRad17(即 Ser635和Ser645位點被丙氨酸替換,不能被磷酸化)檢測點通路功能喪失,其過表達不能對DNA損傷作出適當(dāng)?shù)姆磻?yīng),損傷的DNA既不被檢測也不被修復(fù),基因組不穩(wěn)定性增加,易發(fā)生腫瘤。

也可能是腫瘤細胞快速增殖分裂需要高速的DNA復(fù)制,而這需要額外的檢測活性去捕獲,導(dǎo)致hRad17蛋白過度表達。

MCM7是檢測腫瘤細胞增殖狀態(tài)的標志物,可作為反映乳腺癌細胞增殖活性和判斷其生物學(xué)行為的一個指標。本實驗中hRad17與MCM7的表達有相關(guān)性(P<0.05),提示hRad17有促進細胞增殖的功能。hRad17還可能通過促進腫瘤細胞增殖活性來對乳腺癌的發(fā)生和進展起促進作用。

浸潤性乳腺癌的預(yù)后與病理學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在明顯的關(guān)聯(lián)。乳腺癌的病理學(xué)分級越高或伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,則患者預(yù)后相對越不良。本實驗90例乳腺癌組織中hRad17的陽性率62.2%,MCM7的陽性率84.4%,2種蛋白的陽性表達與乳腺癌病理學(xué)分級呈相關(guān),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中hRad17和MCM7蛋白的表達強于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織,與國內(nèi)外文獻報道相一致[9-10],提示隨著hRad17和MCM7蛋白的活性增高,其促進癌組織侵襲和轉(zhuǎn)移的能力也增強。因此hRad17和MCM7蛋白在癌組織中的高表達與病人的不良預(yù)后有關(guān)?？勺鳛槿橄侔┑念A(yù)后可變量和一個新的治療靶點。

hRad17基因的高表達提高癌細胞對DNA損傷因素(包括治療過程中使用的)的耐受性,可考慮采用基因干擾或特異抑制劑阻遏hRad17的表達,從而減少G2/M期阻滯、促進腫瘤細胞凋亡。

而針對復(fù)制準許因子MCM功能的抑制以阻斷腫瘤細胞的增殖可引起特異的癌細胞滅活作用或許可作為一種新的抗癌靶目標。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示,hRad17和MCM7蛋白的表達在浸潤性乳腺癌中明顯高于良性乳腺病變,同時發(fā)現(xiàn)與乳腺癌進展、浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,并影響其預(yù)后,提示hRad17和MCM7蛋白在乳腺癌組織發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著一定的作用,可作為乳腺癌預(yù)后不良的標志,對hRad17和MCM7基因的深入研究有望為乳腺癌的診斷和治療提供一條有效的途徑。

[1]Parker A E,van de Wayer I,Laus M C,et al.Identification of a human homologue of the Schizosaccharomyces pombe rad17+checkpoint gene[J].J Biol Chem,1998,274(34):18340.

[2]Tavassoli F A,Devilee P.WorldHealth Organization classification of tumors.Pathology&genetics of tumors of the breast and female genital organs[M].Lyon:IARC Press,2003:11.

[3]Bluyssen H A,Naus N C,vanos R I,et al.Human and mouse homologs of the Schizosaccharomyces pombe rad17+cell cycle checkpoint control gene[J].Genomics,1999,55(2):219.

[4]Zou L,Liu D,Elledge S J.Replication protein A-mediated recruitment and activation of Rad17 complexes[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(24):13827.

[5]Lindsey-Boltz L A,Bermudez V P,Hurwitz J,et al.Purification and characterization of human DNA damage checkpoint Rad complexes[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(20):11236.

[6]Lei M,Tye B K.Initiating DNA synthesis:from recruiting to activating the MCM complex[J].J Cell Sci,2001,114(8):1447.

[7]Tsao C C,Geisen C,Robert T,et al.Interaction between human MCM7 and Rad17 proteins is required for replication checkpoint signaling[J].European Molecular Biology Organization,2004,23(11):4660.

[8]Ren B,Yu G,T seng G C,et al.MCM7 amplification and overexpression are associated with prostate cancer progression[J].Oncogene,2006,25(10):1090.

[9]Kataoka A,Sadanaga N,Mimori K,et al.Overexpression of Hrad17 in human breast cancer:correlation with lymph node metastasis[J].Clin Cancer Res,2001,7(9):2815.

[10]任占平,石 吉吉,杜 娟,等.乳腺癌組織中HPV16 18E6及MCM7蛋白的達及意義[J].中國腫腫瘤臨床,2008,35(6):327.