應(yīng)用高速逆流一次性分離川芎中的蛇床內(nèi)酯A和Z-蒿本內(nèi)酯

劉 雯， 吳平麗， 卓 超， 張繼全， 沈平孃*

（1.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海 200237;2.國家中藥制藥工程技術(shù)研究中心，上海 201203）

川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。其性溫，味辛，微苦，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛功效。主治血瘀氣滯所致月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)經(jīng)閉，肝郁氣滯而致血行不暢的胸脅疼痛、頭痛、風(fēng)寒濕痹、跌打腫痛等。

川芎揮發(fā)油含有多種苯酞化合物，其中Z－蒿本內(nèi)酯（Z－Ligustilide）含量最高，超過 1.0%［1］，其次為蛇床內(nèi)酯A（Senkyunolide A）。據(jù)報道，蒿本內(nèi)酯與蛇床內(nèi)酯可以抑制血小板凝聚，松弛子宮、氣管與血管平滑肌，可用于治療咳嗽、月經(jīng)不調(diào)和高血壓等［2－3］。

圖1 蛇床內(nèi)酯A和Z-蒿本內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)Fig.1 The construction of senkyunolide A and Z-ligustilide

蒿本內(nèi)酯與蛇床內(nèi)酯結(jié)構(gòu)均極不穩(wěn)定，短時間內(nèi)即可轉(zhuǎn)換結(jié)構(gòu)［4］。傳統(tǒng)的分離方法不適于蒿本內(nèi)酯的分離，雖然也有文獻(xiàn)報道用半制備高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳分離蒿本內(nèi)酯，但難以避免固相對分離物的吸附。

高 速 逆 流 色 譜 （High－Speed Counter－Current Chromatography，HSCCC）是近幾十年來發(fā)展起來的液－液色譜分離技術(shù)。此項技術(shù)不需要固相載體，只需要被分離物在兩相中分配，避免了固相載體帶來的大量樣品吸附、損失與污染等問題，樣品回收率高，預(yù)處理及后處理都簡便易行，已廣泛應(yīng)用于分離［5－6］。

本研究應(yīng)用HSCCC一次性分離了Z－蒿本內(nèi)酯和蛇床內(nèi)酯A，取得了良好的分離效果。

1 儀器與試劑

TBE－300A型高速逆流色譜儀（上海同田生化有限公司），?KTA purifier P－900 泵，UV－900 紫外檢測器（GE Healthcare美國），HX－1050恒溫循環(huán)器（北京博醫(yī)康），Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent美國）DAD檢測器，實(shí)驗(yàn)室超級純水器（上海賽鴿電子科技有限公司）。

正己烷、乙酸乙酯、乙醇均為分析純，水為超純水，乙腈為色譜純。川芎藥材由上海康橋飲片有限公司提供。

2 分離試驗(yàn)用粗提物的制備

稱取川芎生藥材100 g，粉碎成細(xì)粉，加入600 mL乙醇，加熱回流提取，提取3次，每次2 h，過濾，減壓蒸干，得39 g棕黃色浸膏備用。

3 溶劑體系分配系數(shù)的測定

在溶劑系統(tǒng)的選擇中，樣品組分的分配系數(shù)的測定是相當(dāng)重要的準(zhǔn)備工作，分配系數(shù)是樣品組分在溶劑系統(tǒng)上下相中樣品組分在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)K接近于1（即0.2—3），即分配系數(shù)在此范圍內(nèi)時即可用來分離目標(biāo)產(chǎn)物，溶劑系統(tǒng)適合分離目標(biāo)成分。

根據(jù)文獻(xiàn)［7］報道，選擇正己烷－乙酸乙酯－乙醇－水溶劑系統(tǒng)為基礎(chǔ)，進(jìn)行分配系數(shù)的篩選研究。

稱取浸膏1.0 g左右，共稱取6份，放入20 mL的具塞試管中，按照表1中的溶劑體系，各配制10 mL，分層后，上下層各取2 mL加入到上面的試管中［8］，給予充分的振蕩，搖勻后，再靜置分層，將各個溶劑體系的上下相分別蒸干，使用甲醇溶液定容到1 mL的量瓶中，經(jīng)過針式濾器過濾后，用高效液相色譜計算分配系數(shù)。

4 高速逆流色譜分離試驗(yàn)過程

根據(jù)分配系數(shù)測定的結(jié)果，兩相溶劑系統(tǒng)采用正己烷－乙酸乙酯－乙醇－水（1∶1∶1∶1），臨用前分開上下相，超聲30min。以溶劑系統(tǒng)的上相為固定相，下相為流動相，以9 mL/min的流速將上相泵入管路，待固定相充滿整個管路后，停泵，啟動主機(jī)，把轉(zhuǎn)速調(diào)至892RPM，然后以1.2 mL/min的流速泵入流動相。當(dāng)上下相平衡時，記錄固定相流出的體積，計算得到固定相保留值0.53。供試品100 mg溶解于50 mL流動相，濃度為10 mg/mL，進(jìn)樣量為10 mL，以1.2 mL/min的流速泵入流動相。紫外檢測波長為280 nm，根據(jù)紫外檢測譜圖，收集各峰的組分，將各峰對應(yīng)的收集液分別濃縮，干燥。用HPLC及TLC檢測。

5 結(jié)果

5.1 分配系數(shù)測定結(jié)果

采用文獻(xiàn)報道的HPLC［14］測定方法分析，溶劑體系的分配系數(shù)計算結(jié)果如表1。根據(jù)溶劑系統(tǒng)的選擇原則，選取3、5和6號體系進(jìn)行分離試驗(yàn)考察，結(jié)果表明，3號體系可以達(dá)到最佳分離效果。

表1 樣品組分在各溶劑體系中分配系數(shù)測定結(jié)果Table 1 The K-value of different solvent system

5.2 分離結(jié)果

川芎粗品的HSCCC見圖2。進(jìn)樣60 min后開始出峰，7 h內(nèi)出5個峰，分別對應(yīng)收集流出液。根據(jù)已有文獻(xiàn)的液相條件來初步確定成分，峰4為蛇床內(nèi)酯A，峰5為Z－蒿本內(nèi)酯。

圖2 川芎高速逆流色譜技術(shù)分離結(jié)果Fig.2 The HSCCC result of the separation of Ligusticum chuanxiong Hort

5.3 結(jié)構(gòu)鑒定

5.3.1 核磁共振（NMR）對HSCCC分離峰的結(jié)構(gòu)分析

Z－蒿本內(nèi)酯:1H－NMR（500 MHz，CDCl3，TMS）δppm:6.24（1 H，d，J=9.7，H－7），5.95（1 H，dt，J=9.5，4.4，H－6），5.20（1 H，t，J=7.6，H－8），2.60（2 H，m，H－4），2.42（2 H，m，H－5），2.38（2 H，m，H－9），1.48（2 H，tq，J=7.4，7.8 H－10），0.92（3 H，t，J=7.4，H－11）。以上數(shù)據(jù)與關(guān)于蒿本內(nèi)酯的文獻(xiàn)［9－10］一致。

蛇床內(nèi)酯 A:1HNMR（CDCl3）:1H－NMR（500 MHz，CDCl3，TMS）δppm:6.18（1 H，dt，J=9.6，2.0，H－7），5.92（1 H，dt，J=9.6，3.8，H－6），4.90（1 H，dd，J=7.7，3.8，H－3），2.48（2 H，m，H－4），2.48（2 H，m，H－5），1.9（1 H，m，H－8），1.45（1 H，m，H－8），1.3（2 H，m，H－9），1.3（2 H，m，H－10），0.9（3 H，t，J=7.1，H－11）。以上數(shù)據(jù)與關(guān)于蛇床內(nèi)酯 A的文獻(xiàn)［11－12］一致。

5.3.2 EI－MS對HSCCC分離峰的結(jié)構(gòu)分析

Z－Ligustilide:EI－MS:m/z190.1 ［M+］，161，148，134，105，77，55，Senkyunolide A:EI－MS:m/z192.1 ［M+］，163，135，133，105，79。以上數(shù)據(jù)與關(guān)于Z－蒿本內(nèi)酯及蛇床內(nèi)酯A的文獻(xiàn)［13］一致。5.3.3 HPLC對HSCCC分離峰的純度分析

分別精密稱量4號峰和5號峰干燥物質(zhì)3.1 mg、2.4 mg，用甲醇完全溶解，10 mL 定容，過濾，得供試品溶液。按照文獻(xiàn)［14］給出的高效液相色譜條件，進(jìn)樣量為 10 μL。

根據(jù)面積歸一化法，并且與空白試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對，可以得到蛇床內(nèi)酯A的純度為99.3%，Z－蒿本內(nèi)酯的純度為97.7%。

5.3.4 回收率的計算

以分離得到的相對標(biāo)準(zhǔn)品的量與藥材中蛇床內(nèi)酯A和Z－蒿本內(nèi)酯實(shí)際測得藥材中含量之比，可計算得出蛇床內(nèi)酯A及Z－蒿本內(nèi)酯的回收率。計算可知，蛇床內(nèi)酯 A的回收率較高，可以達(dá)到96.61%，相比，Z－蒿本內(nèi)酯的回收率可以達(dá)到80.08%。

6 討論

使用高速逆流色譜技術(shù)分離出川芎揮發(fā)油中的兩個成分未見報道，我們首次使用此技術(shù)，一次性完成兩個成分的分離及制備，得到兩個活性成分——蛇床內(nèi)酯A和Z－蒿本內(nèi)酯，并且純度均達(dá)到95%以上;蛇床內(nèi)酯的回收率為96.61%，Z－蒿本內(nèi)酯的回收率為80.08%，推測殘留一部分在固定相當(dāng)中。蛇床內(nèi)酯A與Z－蒿本內(nèi)酯的穩(wěn)定性差，使用普通的柱層析分離，耗時長，不易保存和純化;而半制備及制備型液相分離方法成本較高，均不適于快速、大量的制備分離Z－蒿本內(nèi)酯和蛇床內(nèi)酯A。而HSCCC分離過程短，避免傳統(tǒng)方法帶來的固相吸附，預(yù)處理簡單，成本較低，成分得率高，后處理簡便易行。說明HSCCC對于分離穩(wěn)定性差的物質(zhì)具有較大優(yōu)勢。

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